首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 药学论文 > 中药学论文 > 玄栀颗粒微生物限度的检查方法验证分析

玄栀颗粒微生物限度的检查方法验证分析

2020-09-02 225 上传者：管理员

摘要：目的:研究与建立玄栀颗粒的微生物限度检验方法,并进行方法学验证。方法:玄栀颗粒的需氧菌计数、霉菌及酵母菌计数采用2015年版《中国药典》平皿法、稀释剂采用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液,将供试品稀释到相应浓度后,取1mL平均加入5个平皿中,使每个平皿含0.2mL供试品,按规定测定其菌数。控制菌检查采用常规方法检查。结果:需氧菌,霉菌及酵母菌各菌株的回收率均在0.5～2范围内,说明方法可行,控制菌的试验组和阳性对照组生长良好,阴性组没有生长,因此采用常规方法进行控制菌的检查,没有抑菌作用。结论:该微生物限度的检查方法合理可行,专属性强,重现性好,可用于玄栀颗粒的微生物限度检查。

关键词：
微生物限度
抑菌作用
方法验证
检查
玄栀颗粒
加入收藏

玄栀颗粒我院特色中药制剂，因含有抑菌成份，所以需氧菌计数、霉菌和酵母菌计数采用培养基稀释法[1,2,3,4,5]、控制菌检查采用常规法。沙氏葡萄糖琼脂培养基上、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、肠道菌增菌液体培养基、胰酪大豆胨液体培养基、麦康凯琼脂培养基、麦康凯液体培养基、RV沙门菌增菌液体培养基、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基。按产品说明书要求配制。

1、计数方法适用性试验

根据2015年版的“中国药典”中记录关于控制菌检查法相关内容对微生物的控制方法的进行适当性试验及检查。

1.1菌液的制备

在胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物接种于上方，研究人员将温度设置在30℃～35℃之间，并在此温度对菌种进行培养18～24h；在沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上将白色念珠菌的新鲜培养物接种至其中，研究人员将温度设置在20℃～25℃之间，并在此温度对菌种进行培养48～72h。而后研究人员将以上的培养物在pH值为7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液下制成菌悬液。

研究人员在沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上接种黑曲霉的新鲜培养物，并将培养温室温度调整至20℃～25℃，在此温度下培养5～7d。待7d结束后在培养基上加入3～5mL含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液而后将孢子进行操作。而后研究人员用吸管将孢子悬液上清液吸出放置于无菌试管内并用浓度为0.05%的聚山梨酯80的pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液将其制成适宜浓度的孢子悬液。

1.2供试品制备

选用100mL的pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以及10g供试品混合制成浓度为10%的供试液。计数方法适用性试验，供试品批号：玄栀颗粒：20180516、20180517和20180518。

1.2.1试验组

取供试液9.9～100mL无菌三角瓶中，再加入已制备好的金黄色葡萄球菌菌液0.1mL(含菌量为100～10000cfu/mL)，混合均匀后，吸取1mL平均注入5个平皿中，使每个平皿含供试液0.2mL。每株试验菌各制备2mL，共10个平皿。另外取黑曲霉替代金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌，同法制备10个平皿。在各平皿上将20mL上的温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂培养基放置于其中，而后对其进行混匀、凝固等操作，操作结束研究人员将其倒立放置于30℃～35℃的温箱中培养，而含有金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的培养基在培养室间最长不可超过5d，含有白色念珠菌、黑曲霉培养的培养基则不可超过5d。取供试液9.9～100mL无菌三角瓶中，再加入已制备好的白色念珠菌0.1mL(含菌量为100～10000cfu/mL)，混合均匀后，吸取1mL平均注入5个平皿中，使每个平皿含供试液0.2mL。每株试验菌各制备2mL，共10个平皿。另外取黑曲霉替代白色念珠菌，同法制备10个平皿。在各平皿上将20mL温度不超过45℃熔化的沙氏葡萄糖琼脂培养基放置语气中，而后对其进行混匀、凝固等操作，操作结束研究人员将其倒立放置于20℃～25℃的温箱中培养，总培养时间不得超过5d。

1.2.2菌液对照组

分别取0.1mL的金黄色葡萄球菌、黑曲霉(含菌量含菌量为100～10000cfu/mL)、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌，稀释至10mL，取1mL，加入平皿中，测定所加的试验菌数。研究人员在温箱温度为30℃～35℃环境下进行胰酪大豆胨琼脂培养工作，而后对白色念珠菌、黑曲霉、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌进行测定。而放置有沙氏葡萄糖琼脂的培养基则将其放置于温箱温度为20℃～25℃环境下进行培养，培养操作后测定白色念珠菌、黑曲霉。

1.2.3供试品对照组

取供试液1mL，加入5个空平皿中，使每个平皿中含供试液0.2mL；同法制备15个平皿，共20个平皿。平均分成两组，每组10个平皿。在各个平皿上将15～20mL温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂培养基及沙氏葡萄糖琼脂培养基注入其中，而后研究人员进行混匀、凝固操作，操作结束后将其倒立放置于适宜温度环境下，切记培养时间不得超过5d。

1.2.4阴性对照组

分别取1mL稀释剂放置于平皿内，将其分为两组样品，没组均有两个平皿。在不同平皿上注入15～20mL温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂培养基及沙氏葡萄糖琼脂培养基，而后研究人员进行混匀、凝固操作，操作结束后将其倒立放置于适宜温度环境下，切记培养时间不得超过5d。

1.3回收率计算试验组中试验菌回收率=试验组菌落数-供试品对照组菌落数。

菌液对照组菌落数：

通过本次研究分析，应用上述计数方法进行本产品的微生物计数，各菌株的回收率均在0.5～2范围内，说明方法可行。

2、大肠埃希菌检查方法的验证

2.1菌液的制备

研究人员在进行大肠埃希菌检查时候在胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上将大肠埃希菌的新鲜培养物接种至其中，而后研究人员在温箱温度为30℃～35℃环境下进行大肠埃希菌培养工作，培养时间为18～24h，而后使用吸管抽取部分样本并应用pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL小于100cfu的菌悬液。

2.2适用性试验大肠埃希菌检查方法的验证

供试液的制备：

研究人员使用仪器取10g供试品与pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液混合制成100mL的浓度为10%的供试液。

2.3试验组

使用试管抽取10mL的供试液、1mL小于100cfu的大肠埃希菌放置于胰酪大豆胨液体培养基中，而后通过混匀操作，操作结束后研究人员将其放置在温箱温度为30℃～35℃环境下进行培养工作，培养时间为18h。

培养结束后使用吸管抽取1mL溶液放置于100mL麦康凯液体培养基内，而后研究人员在温箱温度为42℃～44℃环境下培养工作，培养时间为24h。在麦康凯琼脂培养基平板上将麦康凯液体培养物放置于表层，而后研究人员将其放置在温箱温度为30℃～35℃环境下培养工作，培养时间为18h。

2.4阳性对照组

研究人员使用吸管抽取1mL小于100cfu的大肠埃希菌并将其放置于胰酪大豆胨液体培养基中，而后进行混匀操作，操作结束后研究人员将其放置在温箱温度为30℃～35℃环境下进行培养工作，培养时间为18h。

培养结束后应用吸管吸取1ml在麦康凯液体培养基，并放在温箱温度为，42℃～44℃环境下再次培养，培养时间为18h。

2.5阴性对照组

用吸管抽取1mL稀释液与100mL胰酪大豆胨液体培养基上，而后研究人员将其混匀，再放入温箱温度为30℃～35℃环境下进行培养工作，培养时间为18h。

培养结束后使用吸管吸取1mL培养物在麦康凯液体培养基上并放在温箱温度为，42℃～44℃环境下再次培养，培养时间为24h。而后再抽取邵少量麦康凯液体培养基接种在麦康凯琼脂培养基平板上。研究人员将其放置在温箱温度为30℃～35℃环境下进行培养工作，培养时间为18h。测定结果见表1。

表1大肠埃希菌检查结果

表1结果显示，试验组生长良好，采用上述方法进行检查，对大肠埃希菌没有抑菌作用。

3、沙门菌检查方法的验证

3.1试验组

在胰酪大豆胨液体培养基内放置10g供试品和1mL小于100cfu的沙门菌并将其进行混匀操作，操作结束后研究人员将其放置在温箱温度为30℃～35℃环境下进行培养工作，培养时间为18h。培养结束后使用吸管抽取0.1mL接种到10mLRV沙门菌增菌液体培养基其中，摇匀后将其放置在温箱温度为30℃～35℃环境下进行培养工作，培养时间为18h。培养结束后在使用吸管抽取少量的RV沙门菌增菌液体培养物放置在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基中，再将其放置在温箱温度为30℃～35℃环境下进行培养工作，培养时间为18h。

3.2阳性对照组

在胰酪大豆胨液体培养基加入1mL小于100cfu的沙门菌并将其进行混匀操作，操作结束后研究人员将其放置在温箱温度为30℃～35℃环境下进行培养工作，培养时间为18h。培养结束后使用吸管抽取0.1mL接种到10mLRV沙门菌增菌液体培养基其中，摇匀后将其放置在温箱温度为30℃～35℃环境下进行培养工作，培养时间为18h。最后在使用吸管收取少量RV沙门菌增菌液体培养物加入木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基其中，摇匀后将其放置在温箱温度为30℃～35℃环境下进行培养工作，培养时间为18h。

3.3阴性对照组

在胰酪大豆胨液体培养基加入1mL稀释液并将其进行混匀操作，操作结束后研究人员将其放置在温箱温度为30℃～35℃环境下进行培养工作，培养时间为18h。培养结束后使用吸管0.1mL培养物接种在10mLRV沙门菌增菌液体培养基中，摇匀后将其放置在温箱温度为30℃～35℃环境下进行培养工作，培养时间为18h。而后在使用吸管收取少量RV沙门菌增菌液体培养物加入木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基其中，摇匀后将其放置在温箱温度为30℃～35℃环境下进行培养工作，培养时间为18h。测试结果见表2。

表2沙门菌检查结果

表2结果显示，试验组生长良好，采用上述方法进行检查沙门菌没有抑菌作用。

4、结论

通过以上验证试验结果，确定本品的微生物限度检查[6]。供试品不需要进行任何处理，可直接稀释溶解后进行实验。需氧菌计数、霉菌及酵母菌计数采用2015年版《中国药典》平皿法、稀释剂采用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将供试品稀释到相应浓度后，取1mL平均加入5个平皿中，使每个平皿含0.2mL供试品，按规定测定其菌数。控制菌检查采用常规方法检查即可。

参考文献：

[1]石上梅.逐步完善中药质量标准体系和质量控制模式—解读2015年版《中国药典》(一部)[J].中国药学杂志,2015,50(20):1752-1753.

[2]宋畅,张丽梅,李俊.抗感灵颗粒微生物限度检查法的验证[J].海军医学杂志,2011,28(03):37-38.

[3]何进,高军,白杨,等.参黄流感颗粒微生物限度检查方法的验证[J].药学服务与研究,2012,12(01):76-78.

[4]沈秉正,李雪珂,杨海峰,喻研.真菌来源的抗微生物多肽研究进展[J].广东药科大学学报,2020,36(02):303-309.

[5]王明欢,刘莹,张英.中药药渣中的微生物固氮､解磷能力测定方法的改进[J].广东药科大学学报,2020,36(02):215-218.

[6]李甜,余成炜.基于微生物检验实验室质量管理分析[J].智库时代,2020,4(14):275-276.

陈继英,吴谋,蓬展鹏,罗四通,周涛.玄栀颗粒微生物限度检查方法的验证[J].医学食疗与健康,2020,18(20):1-2+10.

基金:东莞市社会科技发展科研项目(201750715002372)