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山茱萸萜类合成途径关键酶HMGR1基因的克隆与分析

2020-09-18 168 上传者：管理员

摘要：目的：克隆山茱萸CornusofficinalisHMGR1的cDNA序列并进行生物信息学分析。方法：以山茱萸转录组数据中unigenec100572＿g1序列为参考，在其开放阅读框两端设计特异引物，经实时荧光定量PCR（RT-PCR）扩增、连接pTOPO-T载体克隆并测序，获得CoHMGR1基因的cDNA序列，并利用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行相关分析。结果：CoHMGR1基因长2116bp，含长度为1338bp的完整开放阅读框（ORF），编码445个氨基酸，为疏水性蛋白。多序列比对和亲缘关系分析显示，CoHMGR1基因编码的氨基酸序列与喜树的序列相似性较高，达79.56%。结论：首次对山茱萸叶片和果实进行比较转录组测序的基础上，成功克隆并分析了CoHMGR1基因，为进一步研究CoHMGR1蛋白的功能及山茱萸萜类合成途径的分子机制奠定基础。

关键词：
CoHMGR1
山茱萸
序列分析
药学
萜类
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山茱萸CornusofficinalisSieb.etZucc.是多年生的木本类药用植物，其成熟干燥果肉入药，具有补肝益肾的功效[1]，在临床上应用广泛。山茱萸的果实中含有环烯醚萜、三萜、鞣质和黄酮类等活性物质[2,3]，具有很高的食用价值、药用价值和经济价值。另外，山茱萸在降血糖、抗衰老、抗炎等方面也有很好的效果[4,5]。然而山茱萸的常规生产还存在一些限制因素，例如活性成分含量较低、大规模种植的成活率等。因此，尽管山茱萸的药用价值很高，其常规生产仍满足不了市场需求。另一个原因是提高山茱萸中萜类物质的含量，即可有效增加山茱萸的药用价值。因此运用分子生物学技术研究山茱萸中与萜类生物合成有关的基因极为必要。

萜类也被称为异戊二烯类化合物，是以C5结构元件为前体的衍生物，该前体是异戊烯基焦磷酸（IPP）和IPP的异构体，二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP)[6]。目前在植物体内发现了2条合成IPP及其异构体的途径，即甲羟戊酸途径（MVA）和独立于MVA的非甲羟戊酸（MEP）途径[7]。MEP途径主要为单萜、二萜、光合色素等物质的合成提供前体物质[8]，而MVA是合成倍半萜和三萜类物质的主要途径[9]。MVA普遍存在于真核及原核生物中的细胞质内，HMG-CoA还原酶（HMGR）是MVA途径中的首个限速酶[10,11]，在萜类物质生物合成中具有重要作用，目前已在多种植物中成功克隆[12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22]，但山茱萸中未见其报道。

本研究在课题组对山茱萸果实和叶片进行比较转录组测序的基础上，筛选获得山茱萸HMGR基因的转录本，以此为模板，设计特异性引物，通过RT-PCR技术获得山茱萸的HMGR基因，命名为CoHMGR1。为深入研究CoHMGR1的功能，并最终解释山茱萸环烯醚萜苷合成途径的分子机制奠定基础。

1、材料与试剂

1.1材料

材料采自河南省洛阳市隋唐城遗址植物园，由河南科技大学农学院侯典云副教授鉴定为山茱萸CornusofficinalisSieb.etZucc.植株。分别采集山茱萸植株上新鲜无病害的叶片和果实，用蒸馏水轻轻冲洗干净，擦干水分后立即将其放于液氮内速冻，置于-80℃冰箱内保存。

1.2试剂

TaKaRaMiniBESTPlantRNAExtractionKit于TaKaRa公司购买，TRUEscript1stStrandcDNASynthesisKit,2×longTaqPCRMasterMix以及ZeroBackgroundpTOPO-TACloningKit均购买自艾德莱生物科技公司，DH5α感受态细胞购自上海昂羽生物公司。

2、方法

2.1引物设计与合成

以山茱萸转录组序列获得的HMGR转录本c100572＿g1序列为模板，利用PrimerPremier5.0软件设计一对特异引物，由北京赛百盛基因技术有限公司合成。引物序列CoHMGR1-F:5’-CCAT-CTCCCTCCCACTTT-3’;CoHMGR1-R:5’-AGCC-ACCTACTCTTCCTCAC-3’。

2.2RNA的提取和cDNA的合成

将采取的山茱萸叶片及果实放置在液氮中，充分研磨。按照TaKaRa公司的RNA提取试剂盒操作，提取山茱萸总RNA。利用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取的完整性，并用酶标仪测定其纯度与浓度。得到完整的纯度较高的RNA后，利用TRUEscript1stStrandcDNASynthesisKit提供的方法，将总RNA反转录合成cDNA。

2.3CoHMGR1基因的RT-PCR扩增及测序

以山茱萸的cDNA作模板，构建25L反应体系扩增CoHMGR1基因，依次是2×longTaqMasterMix12.5L,2.5mol/L正、反向引物各1L,cDNA1.5L，最后用ddH2O补至终体积。设定的PCR反应程序为95℃预变性持续5min，设置35个循环，95℃、30s变性，52℃、50s退火，72℃、2min延伸，循环结束后，72℃终延伸10min，程序结束后PCR仪16℃保温。用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，凝胶成像仪拍照记录结果，对目的条带进行切胶回收纯化。

2.4CoHMGR1基因克隆

将凝胶回收的扩增产物连接到pTOPO-T载体上，转化大肠杆菌DH5α，并在含氨苄青霉素的LB平板培养12～14h，挑取单菌落若干用于菌落PCR鉴定，验证后选取阳性菌落送至公司测序，并用80%甘油保存菌种。

2.5CoHMGR1生物信息学分析

利用NCBI提供的ORFfinfer和ConservedDomains-search在线分析其开放阅读码框（ORF）及保守结构域；使用ProtParamtool和ProtScale在线分析CoHMGR1的理化性质与亲/疏水性，利用SignalP4.0server和WOLFPSORT工具分别来预测信号肽和定位信号，以及TMHMMServer在线预测CoHMGR1的跨膜区；利用SOPMA网站在线分析CoHMGR1的二级结构，并利用SWISS-MODEL工具构建其三维模型；使用MEGA7.0构建NJ系统发生树。

3、结果与分析

3.1CoHMGR1基因克隆结果

利用PrimerPremier5.0软件，在转录本c100572＿g1完整的ORF两侧设计引物（CoHMGR1-F和CoHMGR1-R）。以山茱萸的cDNA为模板，经RT-PCR和1.0%的凝胶电泳检测，获得一条约2100bp的亮带。切胶回收该亮带，经与载体pTOPO-T连接，转化DH5，菌落PCR鉴定，挑取阳性克隆测序。测序结果切除载体污染序列，获得长度为2116bp的片段，命名为CoHMGR1。

3.2CoHMGR1理化性质

利用ORFfinder在线预测，CoHMGR1含有长度为1338bp的完整ORF，编码445个氨基酸。经ProtParam在线分析工具的分析结果表明，CoHMGR1蛋白分子式为C2152H3414N578O636S23，相对分子质量为48297.7。其一级结构中丙氨酸（9.7%）、亮氨酸（9.0%）含量较高，而含量较低的有色氨酸（1.3%）、组氨酸（1.1%），其中共48个带正电荷的氨基酸（Asp+Glu),45个带负电荷的氨基酸（Arg+Lys），其理论等电点（pI）值6.04。此编码蛋白的不稳定系数为34.65，表明CoHMGR1蛋白相对稳定。

基于ProtScale工具提供的Hphob/Kyte(5)Doolittle算法来分析CoHMGR1蛋白的亲/疏水性，结果见图1,CoHMGR1蛋白的在第6个氨基酸位点得分最低，分值-2.422，而最高得分2.844位于第91个氨基酸处。总体来看，该蛋白整体的疏水性氨基酸含量要大于亲水性氨基酸，因此初步推定此蛋白为疏水性蛋白。

图1CoHMGR1蛋白亲疏水性预测

3.3信号肽及亚细胞定位预测

利用SingalP4.0server和WOLFPSORT分别在线预测CoHMGR1蛋白的分泌信号和定位情况。SingalP4.0预测结果表明，CoHMGR1蛋白没有信号肽，是非分泌蛋白。WOLFPSORT分析结果显示，chlo:7;mito:4，表明该蛋白有可能于叶绿体或线粒体内存在。

3.4保守结构域与跨膜区预测

利用NCBI提供的CD-search在线分析CoHMGR1编码蛋白的保守结构域，结果见图2，表明该编码蛋白属于HMG-CoA还原酶超家族。使用TMHMMServer工具在线分析CoHMGR1的跨膜区，如图3所示，此蛋白具有2个跨膜区，分别位于41～63位和84～106位氨基酸。

图2CoHMGR1蛋白的保守结构域

图3CoHMGR1蛋白的跨膜区预测

3.5CoHMGR1二、三级结构预测

使用SOPMA软件在线预测CoHMGR1蛋白的二级结构，结果见图4。其中二级结构共有4种，以-螺旋（蓝色，40.67%）和无规卷曲（紫色，40.45%）为主要结构，还有少量的延伸链（红色，13.26%）与β-转角（绿色，5.62%）。利用SWISS-MODEL工具在线预测构建CoHMGR1蛋白的三维结构见图5。结果表明，HMGR1蛋白以3cd0.1.C蛋白作为模板，序列相似性为51.08。

图4CoHMGR1二级结构预测

图5CoHMGR1三维结构预测

3.6CoHMGR1蛋白的同源性分析

将CoHMGR1的氨基酸序列进行BLSATp搜索相似序列，结果显示，CoHMGR1与喜树CamptothecaacuminateL.的HMGR(GeneBank号AAB69727）序列相似性高达79.56%。选取已在NCBI数据库报道过的植物HMGR氨基酸序列，使用MEGA7.0软件，基于邻接法来预测系统（NJ）发生树。结果如图6所示，CoHMGR1与喜树和野茶的HMGR蛋白同源性较高，而与葡萄和莲的HMGR蛋白同源性较低。

图6CoHMGR1的NJ系统发生树

4、讨论

山茱萸作为一种传统药材，不仅是许多中药的成分之一，也被用作很多保健品的原料。作为药用植物的一种，其特有的药用价值的最终来源便是植物次级代谢产生的萜类等有活性的化学成分。但是该类物质含量极低，且野生资源匮乏，常规生产又不足以满足市场需要。因此，急需通过一些分子手段来实现山茱萸等药用植物次生代谢物的大量生产。对于植物来说，特定组织中次生代谢物的合成主要是依赖于其合成基因在转录水平上的调控。

近年来，利用高通量测序技术对传统药用植物转录组的研究已经成为现代研究的重点，RNA-seq技术的发展极大的推动了转录组学的研究[23,24]，现已广泛应用于药学、生物学等领域。目前，已有多种药用植物进行了转录组的研究，并开展了活性成分合成途径关键酶基因的挖掘与分析[25]，为解析这些基因的功能奠定了基础。

甲羟戊酸途径合成IPP及其异构体，而HMG-CoA还原酶催化的过程是该途径中的首个限速步骤[10,11]。HMG-CoA还原酶催化HMG-CoA合成MVA，该酶的活性与MVA的浓度相关，两者之间相互调控[26]。Enjuto等[27]研究表明，在模式植物拟南芥中存在2个不同的基因都能编码HMGR，由此证明了HMGR基因家族有多个成员。目前已经有多种药用植物均克隆出了HMGR基因[28,29,30]，但山茱萸中HMGR基因的相关研究还较为欠缺。

本研究基于高通量转录组测序技术，利用生物信息学的方法[30,31,32]对山茱萸HMGR1基因及其编码蛋白的结构与功能进行预测。CoHMGR1氨基酸序列的同源分析表明，该基因与其他药用植物HMGR序列的相似性较高。对CoHMGR1蛋白结构域的预测结果表明，CoHMGR1蛋白属于HMG-CoA超家族。而CoHMGR1只是山茱萸HMGR基因家族中的一员，其生物学功能以及调控机制还需进一步验证。同时也需克隆山茱萸HMGR基因家族中的其他成员，分析每个成员的功能以及各成员之间有无协同作用等。本研究为深入解析山茱萸HMGR基因家族成员的功能及萜类物质的合成途径提供有效数据。

彻底解析药用植物中HMGR的基因序列及其作用机制，对明确萜类物质合成途径有很重要的作用，而了解萜类合成过程的分子机制，可以大批量生产有活性的萜类物质，也可以提高一些稀有或利用率低的药用植物的经济价值，极大的助力中药事业的发展。因此，以次生代谢途径为基础，利用基因工程技术，通过改进合成途径的调控元件，重构次级代谢途径是实现大批量合成活性物质的有效方法，而改造其途径的关键工作是对关键酶基因进行克隆和转录调控等。

参考文献：

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