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中药复方体外抑制肝细胞增殖研究

2020-10-12 362 上传者：管理员

摘要：目的:观察中药复方对H22细胞增殖率的影响。方法:通过CCK-8法,按照“毒”“痰”“瘀”“虚”的证候要素进行拆方、组方,形成6个中药复方组,作用于H22肝癌细胞,研究不同组别、不同时间的H22细胞增殖率。结果:同一浓度中药复方作用H22细胞72h后效果最好(P<0.05),同一时间中药复方作用H22细胞10μg•L-1浓度效果较好,且全方组和脾虚组效果明显(P<0.05)。结论:通过拆方、组方研究,为临床相关研究提供思路,为临床医师运用中医药诊疗原发性肝癌提供建议和思考。

关键词：
中药学
复方
细胞增殖
肝癌
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本研究通过以往数据挖掘、搜集分析湖北省中医院肝病科病历系统中的原发性肝癌门诊患者[1],以及分析吴寿善等全国名老中医药专家的用药特点,对治疗肝癌的31味高频单味中药进行CCK-8筛选,筛选后结合“毒”“痰”“瘀”“虚”的证候要素特点进行拆方、组方,分别为“毒痰瘀虚全方”“毒痰瘀肾虚方”“毒痰瘀脾虚方”“毒痰瘀肾阳虚方”“毒痰瘀肾阴虚方”“毒痰瘀方”6个中药复方组,由叶下珠、半枝莲、白花蛇舌草、天葵子、旋覆花、皂角刺、丹参、姜黄、党参、炙黄芪、白术、干地黄、续断、沙苑子按照一定比例组成,在不同药物浓度、不同作用时间下,通过CCK-8法,观察各中药复方组对H22细胞的增殖作用。

1、材料与方法

1.1实验药物

中药复方由叶下珠、半枝莲、白花蛇舌草、天葵子、旋覆花、皂角刺、丹参、姜黄、党参、炙黄芪、白术、干地黄、续断、沙苑子组成。

1.2试剂及仪器

CCK-8细胞增殖及细胞增殖检测试剂盒,购自Biosharp公司(批号:BS350B)。0.25%Trypsin,购自Gibco公司(批号:15050065)。RPMI-1640培养基,购自Gibco公司(批号:31800-022)。胎牛血清,购自Gibco公司(批号:10099-141)。微量移液器(ThermoFisher公司),超净工作台(苏州集团安泰空气技术有限公司,型号:SW-CJ-1FD),CO2恒温培养箱(SANYO公司,型号:MCO-15AC),倒置显微镜(OLYMPUS公司,型号:IX51),低速离心机(Eppendorf公司,型号:5702R),酶标仪(Thermo公司,型号:MULTISKANMK3)。

1.3细胞及培养方法

将H22细胞(武汉巴菲尔生物技术服务公司提供,批号:CL-0341)从液氮中取出,快速放入37℃水浴锅中,轻摇冻存管使冻存液溶解;溶解后把细胞转移到含有5mL培养基的离心管中,离心收集细胞,室温1000rpm离心5min,离心半径10cm,弃上清液;用含体积分数10%胎牛血清的完全培养基悬浮细胞,接种到培养皿中,轻轻吹打混匀,37℃体积分数5%CO2饱和湿度条件下培养。

1.4实验分组

毒痰瘀组(叶下珠10g,半枝莲15g,白花蛇舌草15g,天葵子20g,旋覆花10g,皂角刺10g,丹参20g,姜黄20g);肾阴虚组为毒痰瘀组加干地黄20g;肾阳虚组为毒痰瘀组加续断20g,沙苑子20g;肾虚组为毒痰瘀组加干地黄20g,续断20g,沙苑子20g;脾虚组为毒痰瘀组加党参30g,炙黄芪30g,白术30g;全方组为毒痰瘀组加党参30g,炙黄芪30g,白术30g,干地黄20g,续断20g,沙苑子20g,以及正常对照组,共7个组别。每组中药复方浓缩液含生药2μg·L-1、10μg·L-1、100μg·L-1(湖北省中医院制剂室加工)。每组3个复孔,进行检测,重复3次。

1.5CCK-8时间点检测

将H22细胞从液氮中取出,快速放入37℃水浴锅中,轻摇冻存管使冻存液解冻;把解冻后的细胞转移到含有5mL培养基的离心管中,离心收集细胞,室温900rpm离心3min,弃上清液;用完全培养基(含体积分数10%FBS+体积分数1%双抗)悬浮细胞,接种到培养皿中,轻轻吹打混匀,37℃体积分数5%CO2饱和湿度条件下培养。取对数生长期的H22细胞,用培养基(体积分数10%FBS+体积分数1%双抗)调整细胞密度到5×104mL-1,接入96孔板,每组3个复孔,每孔100μL细胞悬液,并设置空白对照孔,在细胞孔周围孔内加入100μL无菌PBS,37℃体积分数5%CO2饱和湿度条件下培养过夜;细胞过夜培养贴壁后,吸去培养基,换成含药(体积分数10%FBS)1640培养基,每孔200μL。体积分数5%CO2,37℃常规培养24h、48h、72h,做CCK-8检测。每孔加入20μLCCK-8,37℃培养2～4h。酶标仪测定各孔吸光值OD450。

1.6CCK-8浓度检测

取生长状态良好的H22细胞,用完全培养基调整细胞密度到8×104mL-1,接入96孔板,每孔100μL细胞悬液,每孔100μL,混匀,37℃培养(在细胞孔周围孔内加入100μL无菌PBS缓冲液);每组3个复孔,药物作用浓度分别为2μg·L-1、10μg·L-1、100μg·L-1、200μg·L-1,按分组加入各组两倍含药浓度的1640含药完全培养基,培养48h后检测。每孔加入20μLCCK-8,37℃培养4h;酶标仪测定各孔吸光值OD450。

1.7统计学方法

统计方法采用SPSS22.0软件分析。所有数据采用均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较釆用LSD检验。所有统计检验均釆用双侧检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

同一浓度不同时间的各个中药复方,对H22细胞的增殖均有明显的影响。细胞培养72h后细胞增殖率最低,影响最明显,其次是48h,最后是24h。细胞培养24h后进行检测,CCK-8的细胞增殖率维持在90%左右,全方组效果最好,其次为肾虚方组。而细胞培养48h后的CCK-8增殖率在80%左右,仍然是全方组效果最好,其次为肾虚方组。细胞培养72h后的CCK-8增殖率在75%左右,其中全方组效果最明显。差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1。

不同浓度的中药复方作用于H22细胞,对细胞的增殖率有不同程度的影响。在药物浓度为2μg·L-1时,全方组效果最好,其次为肾虚组;在药物浓度为10μg·L-1时,全方组效果最好,依次为脾虚组、肾虚组、肾阳虚组、毒痰瘀组、肾阴虚组;在药物浓度为100μg·L-1时,效果最好的为脾虚组,其次为肾阳虚组。差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

图1不同中药复方处理H22细胞24h、48h、72h的增殖率

表1不同浓度中药复方对细胞增殖率的影响(x±s)

3、讨论

肝癌发生的内在条件的最主要因素是癌毒的产生。而环境、社会以及七情六欲、劳倦损伤等均可造成癌毒内生,影响人体的气血运行,气血运行不畅,气机阻滞则成血瘀,气滞血瘀日久则形成肝癌结块。痰邪常常与湿邪相随,痰湿是体内津液代谢失常的产物,五脏六腑功能失调,火热之邪炼液成痰,气化升降失司,水液内停成痰。周仲瑛教授认为,痰又可成为致病因素,随气流行,外至经络筋骨,内达五脏六腑,全身上下内外无处不到,从而可导致多种病变[2]。痰湿内停,阻碍气机的运行,气机运行不畅则易形成结块,痰湿之邪稽留日久化热成毒,容易导致病情的复杂化。刘嘉湘教授提出“因虚受邪说”[3]。王沛教授认为,肝癌属本虚标实之证,提出肝癌的基本病理特点为肝之体用失调,以及瘀、湿、邪毒的蕴结[4]。素体虚弱,易感外邪,内邪相合,则易导致本病的产生;癌病日久,毒、痰、瘀互结,影响机体脏腑正常生理功能,易造成癌病患者后期体质虚弱。肝癌的证候要素是毒痰瘀虚,但在肝癌发生发展的不同时期,毒、痰、瘀、虚四大证候要素的表现轻重不一[5]。

占义平等[6]概括目前肝癌中医研究,指出肝癌的复杂证候主要为肝郁脾虚证、气滞血瘀证、肝胆湿热证、肝肾阴虚证。钱丽丽等[7]通过分析248例原发性肝癌患者的相关数据,得出原发性肝癌的中医证型以肝郁脾虚证、气滞血瘀证、肝肾阴虚证出现频率最高。司富春等[8]对1976—2010年中国知网收录关于中医诊治原发性肝癌的文献进行频度分析,得出肝郁脾虚、肝肾阴虚、气滞血瘀、肝胆湿热为常见证型。总结原发性肝癌的证型特点,可将肝癌的主要证型划分为虚证和实证,虚证包括肝郁脾虚证和肝肾阴虚证,实证包含气滞血瘀证和肝胆湿热证,将其进行划分,涉及的脏腑主要以肝肾两脏为主,病理因素包含气滞、血瘀、湿热,湿与痰密不可分,热毒、气滞可将其归入“毒”,与肝癌“毒、痰、瘀、虚”四大证候要素一致。

本实验通过CCK法,观察中药复方对H22细胞的增殖作用。在同一浓度时,细胞作用72h效果最好,主要考虑中药复方对H22细胞的作用时间越长,其对H22细胞的破坏程度越强,表现出增殖率与时间呈负相关。综合来看,10μg·L-1浓度效果较佳,且全方组、脾虚组与其他组别比较,效果较好。全方组将“毒”“痰”“瘀”“虚”的证候要素考虑在内,符合原发性肝癌的中医病机特点。原发性肝癌的病程中虚证是始终贯彻其中的,主要表现为脾虚的症状以及体征,如恶心、腹胀、腹泻、呕吐等。《外科正宗》云:“忧郁伤肝、思虑伤脾,积想在心,所愿不得志者,致经络痞涩,聚结成核。”可见脾虚既是肝癌的致病因素之一,也是肝癌的病后表现之一。健脾理气是治疗原发性肝癌的重要方法[9]。提示在原发性肝癌的诊治过程中除了要运用叶下珠、半枝莲、白花蛇舌草、天葵子、旋覆花、皂角刺等解毒化痰行气化瘀,更要结合补气健脾等药物。在病程发展中,原发性肝癌患者虚证亦可见肾虚,在肾阴阳两虚中偏于肾阳虚。“肝肾同源”,肝脏和肾脏密切相关。《诸病源候论·虚劳病诸疾》指出:“积者,脏病也,阴气所化生也;聚者,腑病也,阳气所成也。”肾阳为一身阳气之本,正所谓“五脏之阳气,非此不能发”[10]。在后期原发性肝癌的治疗中可考虑加入补骨脂、菟丝子等补肾、补肾阳相关药物。本实验只是从细胞增殖实验出发,按照肝癌各个证候要素进行拆方、组方。本实验结果可为临床运用中药复方治疗肝癌提出一些观点和建议,但并未系统研究药物作用的相关机制,后续将做进一步研究。

参考文献：

[1]张嫚.基于毒痰瘀虚理论的中医药治疗肝癌的用药规律数据挖据研究[D].武汉:湖北中医药大学,2016.

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[3]高虹.刘嘉湘教授辨治肝癌经验[J].辽宁中医杂志,1997,24(6):557-559.

[4]何秀兰,周而复,袁尚华,等.王沛教授治肝癌临床经验总结[J].中国中医基础医学杂志,2004,10(3):70-71.

[5]吴辉坤,李晓东,盛国光,等.肝癌证候要素理论探讨[J].中西医结合肝病杂志,2015,25(5):314-316.

[6]占义平,凌昌全.原发性肝癌中医证候研究概述[J].中医杂志,2017,58(2):167-170.

[7]钱丽丽,赵向丽,冯晓军,等.原发性肝癌证型分布及用药分析[J].河南中医,2018,38(8):1189-1193.

[8]司富春,岳静宇,刘紫阳.近30年临床原发性肝癌中医证型和用药规律分析[J].世界中西医结合杂志,2011,6(1):8-10.

[9]董秀丽,李长华,李炜.原发性肝癌从脾虚论治探讨[J].山东中医杂志,2001,20(8):459-461.

[10]贾恺宁,朱英.从肾论治原发性肝癌[J].时珍国医国药,2017,28(4):932-934.

皇甫炎林,吴辉坤.中药复方体外抑制肝细胞增殖研究[J].中医学报,2020,35(10):2212-2214.