新型冠状病毒肺炎(COVID-19),简称“新冠肺炎”,是一种急性感染性肺炎,其病原体是一种新型冠状病毒,即2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。COVID-19临床主要表现为发热、咳嗽、气促和呼吸困难等,严重者可导致肺炎、严重急性呼吸衰竭、肾衰竭,甚至死亡。COVID-19可引起严重的炎症损伤,发病早期即可损伤免疫系统,治疗时应联合抗病毒治疗与抗炎治疗,中医药在阻断炎症因子形成级联放大反应方面有很大的优势。中医学认为细胞因子风暴引起的急性呼吸窘迫综合征属于“喘脱”“肺胀”范畴,关键病机是“毒瘀互阻,肺气衰败”,治疗要法为“解毒化瘀,大补肺气”[1,2,3]。上海绿谷生命园医药有限公司研制的芩苏胶囊为纯中药制剂,具有清肺活络、解毒化瘀、降逆止咳的功效,药理学研究显示其具有明显的抗炎、抗菌、解热、镇咳、祛痰作用。目前该药正在进行Ⅱ期临床试验,其组方来源于王永炎院士经典临床方芩苏散(由黄芩、紫苏子、紫苏梗、苦参、丹参5味中药组成)。方中以黄芩为君药,清肺热,辅以苦参解毒祛瘀热为臣药,苏子、苏梗共用为臣,疏风宣肺伴降逆化痰,佐以丹参清肺络、化瘀热。全方共奏清肺活络、解毒化瘀、降逆止咳之功。因此,芩苏胶囊对COVID-19具有潜在的治疗作用。

网络药理学是基于系统生物学理论,采用大数据分析和网络可视化技术,研究“药物-靶点-基因-疾病”之间的相互作用关系,分析药物化学成分与机体疾病之间网络干预与影响因素,从整体性与系统性角度阐述药物疾病调控网络的复杂网络关系,是目前中药复方多靶点机制分析与中药药效物质基础分析的重要手段之一。分子对接技术是通过受体的特征以及受体和药物分子之间的相互作用方式来进行药物设计的方法,主要研究分子间(如配体和受体)相互作用,并预测其结合模式和亲合力的一种理论模拟方法[4,5]。

本文运用网络药理学研究方法,对芩苏胶囊与COVID-19相关的基因进行网络药理学分析,推测芩苏胶囊防治COVID-19的生物学途径。运用分子对接技术对芩苏胶囊核心化合物与COVID-19相关的靶点进行分子对接,预测其结合模式和亲合力。本研究运用网络药理学和分子对接技术探讨芩苏胶囊中防治COVID-19的潜在药效物质,以期为芩苏胶囊防治COVID-19的可能性提供理论依据。

1、材料与方法

1.1数据库及分析软件

本研究数据采集和分析采用如下数据库和软件。

(1)数据库:

中药系统药理学数据库与分析平台;中药综合数据库;靶点蛋白数据库Uniprot数据库);GeneCards数据库;DrugBank数据库和OMIM数据库;Venny分析工具;蛋白质相互作用分析平台String数据库;基因功能与信号通路富集分析数据库DAVID;RSCB蛋白质结构数据库PDB;小分子化合物结构查询数据库PubChem。

(2)分析软件:

网络拓扑分析软件Cytoscape3.7.2;分子对接软件ChemBioOffice;Pymol;AutoDockTools。

1.2有效成分的收集及潜在靶点的预测

以芩苏胶囊中各单味药的中药名称(黄芩、苦参、丹参、紫苏子和紫苏梗)为检索词,在TCMSP数据库中检索芩苏胶囊的全部化学成分,在TCMSP未检索到的中药,从TCMID数据库和相关文献中补充[6]。并根据生物利用度(OB)≥30%,类药性(DL)≥0.18筛选,得到芩苏胶囊的有效成分和相应的靶标蛋白。将所有靶点运用Uniprot数据库以“Homosapiens”(人属)为关键词进行基因-蛋白名称转化,即将全部蛋白名称转换为基因名称。

1.3COVID-19相关靶点的获取

以“novelcoronavirus”为检索词,通过GeneCards[7]、DrugBank和OMI数据库,预测与COVID-19相关的作用靶点[7,8,9]。

1.4蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络的构建与分析

利用Venny分析工具,将活性成分对应的靶点与疾病靶点进行合并,交集是芩苏胶囊与COVID-19的共同靶点,导入String数据库,限定物种为“HomoSapiens”,以置信度(0.4)为条件筛选,获取蛋白相互作用关系,构建PPI网络。分析结果保存为TSV格式文件,导入Cytoscape3.7.2软件,并运用“NetworkAnalyzer”功能分析其拓扑学属性,根据结合节点度值大小,筛选出核心靶点[10]。

1.5“中药-化合物-靶点”网络的构建

将筛选出的靶标蛋白基因列表、活性成分、药物等信息输入Cytoscape3.7.2软件,构建“中药-化合物-作用靶点”网络,并运用“NetworkAnalyzer”功能分析其拓扑学属性,导出其相关的拓扑数据,如度值(degree)、介值(betweennesscentrality,BC)等。

1.6靶点的通路分析

为探究靶标蛋白信号转导途径与功能,将筛选得到的芩苏胶囊潜在的作用靶点导入DAVID数据库,通过输入靶基因名称列表并限定物种为“人”,进行GO生物学过程和KEGG信号通路富集分析。选取前20个条目,并用在线绘图站BoxPlot将结果绘制成柱状图与气泡图进行可视化。

1.7“成分-靶点”分子对接

PDB数据库中下载SARS-CoV-23CL水解酶的晶体复合物(PDBID:6LU7)和血管紧张素转化酶Ⅱ(angiotensinconvertingenzyme,ACE2)的晶体复合物(PDBID:1R42)用于分子对接研究;将筛选出来的核心化合物通过PubChem下载其3D结构式,运用ChemBioOffice软件使其能量最小化,保存为mol2格式。

运用PDB数据库下载靶蛋白的三维晶体结构,采用Pymol软件去除靶蛋白的水分子,分离配体和受体,保存为pdb格式,再借助AutoDockTools1.5.6添加非极性氢,计算Gasteiger电荷,分别保存为pdbqt格式的文件。

将保存的mol2格式化合物导入AutoDockTools1.5.6,添加原子电荷,分配原子类型,所有柔性键均默认可旋转,保存为pdbqt格式,作为对接配体。

根据SARS-CoV-23CL水解酶以及血管紧张素转化酶Ⅱ(ACE2)自带的配体定义活性位点,设置GirdBox坐标[11]。

SARS-CoV-23CL水解酶活性中心GirdBox坐标:center_x=-9.641,center_y=12.597,center_z=68.789;size_x=60,size_y=60,size_z=60,spacing=0.375,其他参数默认;血管紧张素转化酶II(ACE2)活性中心GirdBox坐标:center_x=80.227,center_y=66.360,center_z=38.452;size_x=60,size_y=60,size_z=60,spacing=0.6,其他参数默认。

运行AutoDock4.2软件进行对接,采用PyMol分子可视化软件对对接结果进行处理,并最终以图片的方式展示[12,13,14]。

2、结果

2.1芩苏胶囊治疗COVID-19的潜在靶标

通过TCMSP、TCMID与已有文献报道,检索到芩苏胶囊中5味中药中的化合物共615个。由于芩苏胶囊的给药方式是通过口服,类药性(DL)值表示成分与已知化学药物的相似性,对确定中药成分是否具有活性有重要参考价值。一般认为OB值越大代表药物生物活性成分的DL越好[15,16]。以OB≥30%和DL≥0.18为筛选标准,除重后有效成分共121个,其中紫苏梗已知化合物有29个,但其有效成分均不在筛选标准内,4味药材除重后共预测靶标274个。方中各药材有效成分和预测靶标数量见图1,部分药材有效成分信息见表1。

图1芩苏胶囊“化合物-有效成分-靶标”统计信息

2.2COVID-19靶点的收集与PPI网络的构建

先以“novelcoronavirus”为关键词,通过OMIM、Gencards、Drugbank数据库检索,选择物种为“Homosapiens”(人属),检索出与COVID-19相关的靶点513个,与芩苏胶囊的274个靶点进行交集分析后有65个共同靶点。见图2。

将65个交集靶点信息导入String数据库,构建靶蛋白相互作用的PPI网络。如图3所示,网络中共包含65个节点和920条边。度值大的靶点在网络中可能起着关键的枢纽作用。靶蛋白的平均节点度值为28.3,有33个靶点的度值大于平均值,分别是IL-6、TNF、TP53、CASP3、ALB、MAPK1、IL10、CXCL8、PTGS2、CCL2、FOS、MAPK14、RELA、EGFR、IL1BCASP8、IL-4、BCL2L1、ICAM1、ESR1、IL-2、PTEN、IFNG、PPARG、STAT1、NOS3、HMOX1、TNFRSF1A、CXCL10、TGFB1、NOS2、CRP和APP。这33个靶点可能是芩苏胶囊发挥治疗COVID-19作用的关键靶点(图4)[17]。

表1芩苏胶囊中部分有效成分的基本信息

图2芩苏胶囊与COVID-19靶点韦恩图

2.3“中药-化合物-靶点”网络的构建与分析

运用Cytoscape3.7.2软件构建“中药-化合物-靶点”网络(图5),有4个药材节点、121个化合物节点及274种靶点节点,共计399个节点和1960条边。其中黄色圆形代表黄芩、丹参、苦参和紫苏子的化合物,蓝色长方形代表活性成分所对应的靶点。

图3芩苏胶囊作用靶点的PPI网络

图4芩苏胶囊作用的关键靶点

借助Cytoscape3.7.2软件中的“Networkanalyze”功能对网络进行拓扑属性分析,其中度值与介值是衡量1个节点在网络中起到关键性的2个重要参数值。以节点的度值和介值的平均值作为参考标准,筛选出度值和介值皆大于平均度值的化合物和靶点作为核心化合物和核心靶点。共得到14个核心化合物,分别为木犀草素、槲皮素、β-谷甾醇、植物甾醇、汉黄芩素、丹参酮ⅡA、花生四烯酸、鼠尾草酚酮、黄芩素、刺芒柄花素、4-亚甲丹参新酮、隐丹参酮、金合欢素和千层纸素A,分别与170、147、74、62、43、40、39、36、35、33、31、29、24、24个靶点蛋白能相互作用;同时,排名前14的核心靶点为PTGS2、PTGS1、SCN5A、NCOA2、ADRB2、NCOA1、DPP4、PRSS1、RXRA、AR、ESR1、CHRM1、PIK3CG、CHRM3,分别能与104、69、60、51、50、49、45、44、44、43、36、35、32、32个活性化合物发生作用。见表2。

2.4GO及KEGG靶点通路富集分析

2.4.1GO富集分析

运用DAVID数据库,GO富集分析得到GO条目(P<0.05),包含420个生物过程条目,43个细胞组成条目,64个分子功能(molecularfunction,MF)条目。按-lgP值排序,分别选取前20条目,见图6。图6中的前20个BP条目、CC条目和MF条目类别分别由绿色、橙色和蓝色的条形表示。

表2中药-化合物-靶点网络关键节点及其拓扑学特征(前14位)

在生物过程(BP)中,靶点主要涉及药物应答、炎症反应、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、脂多糖的细胞应答等。

在细胞组成(CC)中,靶点主要涉及细胞外隙、细胞溶质(cytosol)、细胞外区、细胞周质区等。

在分子功能(MF)中,靶点主要涉及蛋白结合、酶结合(enzymebinding)和细胞因子活性等。

2.4.2KEGG通路富集分析

运用DAVID数据中KEGG通路富集分析得到111条(P<0.05)信号通路,按-lgP值排序,选取前20个信号通路,绘制可视化气泡图,见图7中KEGG。主要涉及查加斯病(Chagasdisease)、乙型肝炎(HepatitisB)、TNF信号通路、利什曼病、癌症通路、弓形虫病、甲型流感(InfluenzaA)、肺结核(Tuberculosis)、百日咳(Pertussis)、阿米巴病(Amoebiasis)、HIF-1信号通路(HIF-1signalingpathway)、Toll样受体信号通路、炎症性肠病、疟疾(Malaria)、鞘脂信号通路、T细胞受体信号通路、NOD样受体信号通路、破骨细胞分化、细胞因子受体相互作用以及沙门氏菌感染等信号通路。

图5芩苏胶囊的中药-化合物-靶点网络图

图6芩苏胶囊作用靶点的GO富集分析

其中乙型肝炎涉及的靶点有PRKCA、PIK3CG、IL6、TNF、RELA、TP53、CXCL8、RB1、CDK4、STAT1、PTEN、TGFB1、PRKCB、MAPK1、FOS、CASP3、BAX、BCL2、CASP8,甲型流感涉及的靶点有PRKCA、PIK3CG、ICAM1、IL6、TNF、CCL2、RELA、CXCL8、STAT1、PRKCB、CXCL10、MAPK1、TNFRSF1A、MAPK14、IFNG、IL1B、IL1A;

肺结核涉及的靶点有IL6、TNF、RELA、STAT1、IL10、TGFB1、TNFRSF1A、MAPK1、CASP3、BAX、MAPK14、BCL2、CASP8、IFNG、IL1B、NOS2、IL1A;

百日咳涉及的靶点有MAPK1、FOS、CASP3、IL6、TNF、MAPK14、RELA、IRF1、CXCL8、IL1B、NOS2、IL10、IL1A。

图7芩苏胶囊作用靶点的KEGG富集分析

2.5分子对接

本研究借助分子对接技术将芩苏胶囊中的14个核心化合物配体与受体蛋白SARS-CoV-23CL水解酶和ACE2进行结合。普遍认同配体与受体结合时能量越低越稳固,则发挥作用的可能性越大。通常将结合能≤-5.0kJ/mol作为筛选标准,结果显示,14个核心化合物与3CL水解酶和ACE2结合能均远远小于-5.0kJ/mol。如表3所示,芩苏胶囊中的核心化学成分相较于目前报道有效西药(氯喹、瑞德西韦、利巴韦林)与受体蛋白SARS-CoV-23CL水解酶和ACE2的结合能无显著差异,除花生四烯酸低于上述3个西药,其余13个核心化合物均高于氯喹、瑞德西韦、利巴韦林。结果显示,芩苏胶囊14个核心化合物与SARS-CoV-23CL水解酶和ACE2能形成构象能量低、稳固、结合活性较高。

图8展示了芩苏胶囊中的部分核心化合物丹参酮ⅡA、汉黄芩素、黄芩素、木犀草素、隐丹参酮与SARS-CoV-23CL水解酶和ACE2分子对接模式。分子对接结果显示,丹参酮ⅡA上的羟基与3CL水解酶中的CYS145和LEU4通过氢键结合;汉黄芩素上烷基与3CL水解酶中的THP26和GLY143通过氢键结合;黄芩素中的羟基与3CL水解酶中的HIS163,烷基与3CL水解酶中的HIS163、GLY143、SER144、CYS145分别形成氢键结合力;木犀草素中的羟基与3CL水解酶中的HIS163,烷基与3CL水解酶中的HIS163、GLY143、SER144、LEU141、GLU166分别通过氢键结合;隐丹参酮中的羟基与3CL水解酶中的SER144、CYS145、HIS163、LEU141通过氢键进行结合。以上结果表明,上述化合物均能很好地结合到COVID-193CL水解酶上。

同理,丹参酮ⅡA通过羟基与ACE2上的ASN210形成氢键结合力,汉黄芩素中的羟基与ACE2上的LYS94、ASN210,烷基与ACE2上的GLU208分别形成氢键结合力;黄芩素中的羟基与ACE2上的GLU564,烷基与ACE2上的GLN93、GLU208、LYS94分别形成氢键结合力;木犀草素中的羟基与ACE2上的ASN210,烷基与ACE2上的ASN210、ASP206、SEF563也分别形成氢键结合力;隐丹参酮中的羟基与ACE2上的ASN210通过氢键结合,以上分子对接结果表明,这些化合物均能很好地结合到COVID-19血管紧张素转换酶Ⅱ上。

表3芩苏胶囊中核心化合物和部分临床治疗西药分别与SARS-CoV-23CL水解酶及ACE2的结合亲和力

图8丹参酮ⅡA、汉黄芩素、黄芩素、木犀草素、隐丹参酮与SARS-CoV-23CL水解酶和ACE2的分子对接模式

2.6芩苏胶囊质谱分析

采用超高效液相色谱-质谱联用方法(UPLC-Q-TOF/MS)对芩苏胶囊进行了分析,通过天然产物高分辨质谱数据库比对,从芩苏胶囊中指认出68个化学成分,从中鉴定了22个成分。表4为芩苏胶囊5个核心化学成分质谱鉴定结果。

表4芩苏胶囊5个核心化学成分质谱鉴定结果

3、讨论

自COVID-19疫情发生以来,国内积极研究中医药在COVID-19治疗中的作用。在湖北确诊病例的救治中,中医药参与度在75%以上,上海市确诊病例的中医药使用比例达到90%[18]。COVID-19属中医“疫病”范畴,病因为感受疫戾之气,病位在肺脾,病性为湿毒,基本病机特点为湿、热、毒、虚[19]。芩苏胶囊由黄芩、紫苏子、紫苏梗、苦参、丹参5味中药组成。方中以黄芩为君药,清肺热;辅以苦参解毒祛瘀热为臣药,苏子、苏梗共用为臣,疏风宣肺伴降逆化痰;佐以丹参清肺络、化瘀热。全方共奏清肺活络、解毒化瘀、降逆止咳之功。

本研究先借助网络药理学研究方法筛选出芩苏胶囊中的有效化学成分121个,作用靶点274个。通过“中药-化合物-靶点”网络的构建,得到芩苏胶囊的关键节点及拓扑学特征,排序前14位的核心化合物分别为木犀草素、槲皮素、β-谷甾醇、植物甾醇、汉黄芩素、丹参酮ⅡA、花生四烯酸、鼠尾草酚酮、黄芩素、刺芒柄花素、4-亚甲丹参新酮、隐丹参酮、金合欢素和千层纸素A;同时,度值大的靶点在网络中可能起着关键的枢纽作用。芩苏胶囊中可能发挥治疗COVID-19肺炎作用的关键靶点有33个,其中排序前3位的是IL-6、TNF、TP53靶点。普遍认为,病毒不是直接造成患者重症肺炎,而是病毒先诱发机体产生失调的、过度的免疫应答,导致患者体内炎症因子过度表达而出现“细胞因子风暴”,从而间接造成肺炎及急性肺损伤[20]。芩苏胶囊中的关键靶点大部分与炎症因子相关,与COVID-19的炎症因子释放相吻合。芩苏胶囊中排序首位的关键靶点IL-6是多功能炎性细胞因子,是炎性介质网络的关键成分,在炎症反应中起到重要作用[21]。GO及KEGG靶点通路富集分析得出420个生物过程、43个细胞组成、64个分子功能以及111条KEGG信号通路。GO功能分析主要涉及药物应答、炎症反应、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、脂多糖的细胞应答等生物过程;KEGG通路中乙型肝炎、甲型流感、肺结核、百日咳、阿米巴病、沙门氏菌感染、疟疾、结核病属于病毒感染,与COVID-19感染源相似。

在分子对接过程中,本研究将芩苏胶囊中的14个核心化合物配体与受体蛋白SARS-CoV-23CL水解酶和ACE2全部进行分子对接。结果显示,模型对接效果好且结构稳定,提示芩苏胶囊可能通过IL-6、TNF、TP53等靶蛋白干预COVID-19来改善临床症状,促进机体修复。另外,芩苏胶囊中的核心化学成分相较于目前报道的有效西药(氯喹、瑞德西韦、利巴韦林)与受体蛋白SARS-CoV-23CL水解酶和ACE2的结合能无显著差异。芩苏胶囊的核心成分中木犀草素、槲皮素、黄芩素和汉黄芩素属于黄酮类成分,且木犀草素、槲皮素在相关研究中,都提示可能在抑制SARS-CoV病毒复制中发挥重要作用[22,23,24]。国内外研究普遍认为,黄酮类成分是一类常见活性成分,有较好的抗炎效果,而且毒副作用小。芩苏胶囊中的黄芩具有清热燥湿、止血安胎、泻火解毒、抗癌、抗菌、抗病毒等功效。黄芩提取物中的黄酮类化合物是其主要的药效组分,包括黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素[25,26]。

本研究前期通过采用超高效液相色谱-质谱联用方法(UPLC-Q-TOF/MS)对芩苏胶囊进行了分析,从芩苏胶囊中指认出68个化学成分,从中鉴定了22个成分,分别是苦参碱、槐定碱、氧化槐果碱、氧化苦参碱、氧化槐定碱、夏佛塔苷、芒柄花素、迷迭香酸、黄芩苷、丹酚酸B、三叶豆紫檀苷、木犀草素、丹酚酸A、千层纸素A7-O-葡萄糖醛酸、汉黄芩苷、芹菜素、黄芩素、汉黄芩素、苦参酮、丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮ⅡA。以上成分与芩苏胶囊网络药理学研究排序靠前的14个核心化合物中的5个重合,分别为黄芩素、汉黄芩素、隐丹参酮、丹参酮ⅡA和木犀草素。这5个成分可能是芩苏胶囊治疗COVID-19的潜在药效成分。

综上所述,本研究应用网络药理学和分子对接技术的研究方法对芩苏胶囊中的化学成分、作用靶点和核心活性成分以及与SARS-CoV-23CL水解酶和ACE2结合能进行了探索性研究,结果提示芩苏胶囊可能通过多成分、多靶点、多通路的协同作用来治疗COVID-19。但仅通过网络药理学和分子对接技术进行理论探讨存在一定的局限性,后期应该进一步围绕药效学评价、代谢组学、临床疗效等开展实验研究,为芩苏胶囊治疗COVID-19以及后期的药物开发提供理论和实验依据。

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