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不同生长年限大血藤药材中7种成分的含量比较

2020-10-16 698 上传者：管理员

摘要：目的：研究不同生长年限大血藤药材中7种活性成分的动态变化，为大血藤的标准化种植、采收及质量控制提供参考。方法：采用高效液相色谱法，分别测定不同生长年限的人工栽培及野生大血藤中7种成分的含量;采用AgilentExtendC18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)，流动相为甲醇-0.2%乙酸水溶液，梯度洗脱，检测波长280nm(红景天苷、没食子酸和原儿茶酸)、254nm(大黄素)、327nm(咖啡酸、香草酸和绿原酸)，流速1.0mL•min-1，柱温30℃。结果：1～5年生人工栽培大血藤中没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、香草酸、红景天苷、大黄素的含量分别为0.3803～1.3625、0.2558～1.7718、0.6023～6.7012、0.0842～2.7145、0.2661～2.3415、0.0447～0.9014、0.0175～0.4327mg•g-1。7种成分在测定浓度范围内的线性关系良好，r均大于0.9994，精密度、重复性和稳定性良好;平均回收率为98.43%～101.90%,RSD为0.89%～1.75%。结论：不同生长年限的大血藤中7种成分的含量差异明显，1～3年生大血藤中7种成分的含量较低，4年生的含量显著升高，4～5年生的含量趋于稳定;说明大血藤种植4年即可采收。

关键词：
中药学
大血藤
生长年限
高效液相色谱法
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大血藤为木通科植物大血藤Sargentodoxacuneata(Oliv.)Rehd.etWils．的藤茎，别名血藤、红皮藤、大活血等，具有清热解毒、理气活血、祛风杀虫、消肿散结、止痛、通经、败毒等功效[1]。研究表明:大血藤含有多种化学成分，具有免疫抑制、抗菌、抗炎、保护心血管系统、抗肿瘤等生物活性，临床应用广泛[2]。现采用HPLC波长切换法，测定50批1～5年生长年限的人工栽培及野生大血藤药材中没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、香草酸、红景天苷、大黄素等7个指标成分的含量，探索大血藤中成分的动态累积与生长年限之间的关系，为大血藤药材的合理开发与利用提供参考。

1、实验部分

1.1仪器与试药

2695型高效液相色谱仪(美国Waters)。没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、香草酸、红景天苷、大黄素等对照品(中国食品药品检定研究院)批号分别为:110756-201512、110831-201605、110809-201205、110753-201817、110885-201703、110776-201503、110818-201708，纯度分别为:90.8%、99.9%、96.8%、99.7%、99.8%、98.8%、98.7%;甲醇为色谱纯;水为纯化水;其余试剂为分析纯;50批大血藤样品，均鉴定为木通科植物大血藤Sargentodoxacuneata(Oliv．)的干燥藤茎，其中，25批野生样品均采自安顺市普定县，5批栽培样品(ZP-06～ZP-10)来源永胜松坪草乌种植基地，其余20批栽培样品均来源于青场镇火冲村大血藤种植示范基地(表1)。

1.2方法与结果

1.2.1溶液的制备

分别取适量没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、香草酸、红景天苷、大黄素等对照品，精密称定，置同一25mL量瓶中，加入适量50%甲醇，超声溶解，取出，放至室温，用50%甲醇定容，制成没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、香草酸、红景天苷、大黄素浓度分别为0.4962、0.8563、3.125、1.173、0.9859、0.4583、0.1986mg·mL-1的混合对照品贮备液。精密量取2mL贮备液，置50mL量瓶中，加50%甲醇定容，即得对照品混合溶液。分别取约1.0g样品粉末(过2号筛)，精密称定，置具塞锥形瓶中，加100mL50%甲醇，精密称定，25℃以下超声(300W,40kHz)30min，放至室温，再次精密称定，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得供试品溶液[3]。

1.2.2色谱条件与系统适用性的试验

采用AgilentExtendC18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)，检测波长280nm(红景天苷、没食子酸和原儿茶酸)、254nm(大黄素)、327nm(咖啡酸、香草酸和绿原酸)，流速1.0mL·min-1，柱温30℃，进样量10μL，流动相为甲醇(A)-0.2%乙酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～8min、12%～35%A,8～22min、35%～45%A,22～32min、45%～66%A,32～41min、66%～40%A,41～50min、40%～12%A)。精密吸取混合对照品和供试品溶液各10μL，在此色谱条件下分别进样测定，记录色谱图。结果在该色谱条件下，7个成分之间且与相邻杂质峰之间均能基线分离，色谱峰理论板数以绿原酸计>4.5×103;供试品溶液在7个待测成分相应保留时间处均有检出(图1)。

表150批样品的采集信息

1.2.3线性关系的考察

分别精密量取0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mL混合对照品贮备液，置50mL量瓶中，加50%甲醇定容，于“1.2.2”项色谱条件下进样分析，记录峰面积。以进样量为横坐标、峰面积为纵坐标作线性回归，各待测各组分的回归方程、线性范围和相关系数见表2。

图1混合对照品(A)与供试品(B)溶液的HPLC图

表27种成分的回归方程、相关系数及线性范围

1.2.4精密度、稳定性与重复性的试验

取混合对照品溶液，连续进样6次，记录色谱图，计算得没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、香草酸、红景天苷、大黄素峰面积的RSD分别为1.32%、0.84%、1.07%、1.25%、0.66%、1.23%、0.96%，表明仪器精密度良好。取供试品溶液(批号:ZP-16)，分别于制备后0、4、8、16、20、24h时进样分析，记录色谱图，计算得没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、香草酸、红景天苷、大黄素峰面积的RSD分别为1.31%、0.93%、1.40%、0.82%、1.22%、1.37%、1.40%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。称取约1.0g4年生大血藤样品(批号:ZP-16)，共6份，精密称定，按“1.2.1”项方法制备供试品溶液，并在“1.2.2”项色谱条件下进样，记录色谱图。计算得没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、香草酸、红景天苷、大黄素的平均含量分别为1.0624、1.7689、6.2345、2.4154、2.0416、0.8976、0.4178mg·g-1,RSD值分别为1.31%、0.87%、1.14%、1.45%、1.62%、1.28%、1.77%。表明该方法重复性良好。

1.2.5加样回收率的试验

取已知含量的4年生大血藤样品粉末(批号:ZP-16)约0.5g，共9份，分别精密加入1.0mL混合对照品贮备液，按“1.2.1”项方法制备供试品溶液，分别进样分析，计算各成分的含量。计算得没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、香草酸、红景天苷、大黄素的回收率分别为99.11%、98.43%、99.59%、101.90%、99.12%、100.72%、99.43%,RSD分别为1.18%、1.12%、1.15%、1.75%、1.33%、0.89%、1.29%(表3)。

1.2.6样品的含量测定

取50批大血藤样品，按“1.2.1”项方法制备供试品溶液，并在“1.2.2”项色谱条件下分别进样，记录色谱图，按外标法计算样品中没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、香草酸、红景天苷、大黄素的含量(表4)。不同年限大血藤中7种成分的含量变化见图2。

表3回收率试验的结果(n=9)

2、讨论

分别考察了乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.2%甲酸水溶液、1%冰乙酸-甲醇、甲醇-0.2%乙酸溶液4种流动相系统[4]，结果甲醇-0.2%乙酸溶液梯度洗脱时，基线平稳，色谱峰峰型尖锐，7种成分与相邻杂质峰的分离完全，对称因子为1.09～1.44，因此采用该流动相系统。采用二极管阵列检测器在210～400nm扫描，没食子酸在217、272nm处有最大吸收，原儿茶酸在561、295nm处有最大吸收，绿原酸在234、323nm处有最大吸收，红景天苷、咖啡酸、香草酸、大黄素分别在278、327、320、254nm处有最大吸收[5,6,7,8,9]。为保证测定的准确性及减少检测器频换切换造成的干扰，采用文中波长设置。中药材的采收是否合理，直接影响着药材的质量。为避免因产地、采收时间不同而对大血藤药材中7种成分的含量造成差异，选择从同一种植示范基地采收样品。从测定结果分析:样品中绿原酸的含量较高，7种成分的含量随着年限的增长呈上升趋势;原儿茶酸的含量在3年生样品中有显著增长;红景天苷、没食子酸、绿原酸、香草酸的含量在4年生样品中有显著增长，4～5年生样品中的增长较缓慢;大黄素的含量较低，增长不明显。7种成分在不同生长年限栽培大血藤药材中的含量略高于相同生长年限的野生药材，这可能与栽培技术逐渐成熟有关。大血藤药材中7种活性成分的含量自4年以上达到稳定，因此，建议人工种植大血藤的最佳采摘年限是4年。文中所用法操作简便、灵敏度高、准确反映了不同生长年限栽培和野生大血藤中化学成分含量的差异，为大血藤药材的质量评价提供了依据。

表4样品的测定结果(mg·g-1,n=3)

图2不同生长年限大血藤中7种成分的含量分布图

参考文献：

[1]中华人民共和国国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京:中国医药科技出版社,2015:20.

[2]邓翀,颜永刚.多指标综合评价优选大血藤酚酸类化合物的提取工艺[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(13):12-14.

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[4]王英,洪伟勇,王金明.高效液相色谱法同时测定大血藤中原儿茶酸和绿原酸的含量[J].新中医,2016,48(2):241-243.

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