首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 药学论文 > 中药学论文 > HPLC法测定苏格木勒-10中5种成分

HPLC法测定苏格木勒-10中5种成分

2021-12-17 382 上传者：管理员

摘要：目的建立HPLC法测定苏格木勒-10（益智、干姜、荜茇等）中5种成分的含量。方法该药物75%甲醇提取液的分析采用AgilentC18色谱柱（4.6mm×250mm,5μm）;流动相水（含0.2%磷酸）-乙腈,梯度洗脱;体积流量0.8mL/min;柱温30℃;检测波长205、238nm。结果6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、圆柚酮、杨芽黄素分别在30.086～170.076μg/g（r=0.9999）、5.865～45.91μg/g（r=0.9999）、12.73～30.8μg/g（r=0.9998）、599.232～2592.0159μg/g（r=0.9999）、1.354～4.0178μg/g（r=0.9997）范围内线性关系良好,平均加样回收率分别为99.09%、88.72%、100.74%、96.80%、95.08%,RSD分别为0.84%、1.42%、1.11%、3.03%、1.12%。结论该方法准确可靠,专属性好,可用于苏格木勒-10的质量控制。

关键词：
10-姜酚
6-姜酚
8-姜酚
HPLC
圆柚酮
杨芽黄素
苏格木勒-10
加入收藏

苏格木勒-10是始载于《四部医典》的主治肾寒、尿闭、结石病的蒙药复方[1],由益智、干姜、白硇砂、荜茇等10味药材组成，疗效显著[2,3]。方中君药益智中的圆柚酮、杨芽黄素[4]具有保护肾脏，抗肿瘤增殖和促凋亡[5],抗炎[6]和抗应激[7],抑制炎症、凋亡和自噬[8,9,10],调节免疫等作用，可用于多种肾脏疾病的治疗；使药干姜所含6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚具有抗心肾损伤[11,12],抗炎[13],抑制肿瘤活性，抗氧化[14],抗卵巢癌[15,16]作用。目前。关于苏格木勒-10质量研究的报道集中在个别单药单一成分含量测定上[17,18,19],难以完整系统地体现该蒙药方剂成分的多样性。因此，本实验采用HPLC法测定方中君药益智主要成分圆柚酮、杨芽黄素，以及使药干姜主要成分6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的含量，以期为完善其质量标准提供参考。

1、材料

1.1 仪器

ULMATE3000高效液相色谱仪(美国ThermoFisherScientific公司);NikonE200电子显微镜、DS-U3拍照装置(北京恒三江仪器销售有限公司);T-1700M马弗炉(郑州天纵电气设备有限公司);DHG-9023A电热恒温箱(宁波江南仪器厂);AUY-120电子天平(最大210g,感量0.01mg,日本岛津公司);KQ-100E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);MILLIPORE型纯水机[序列号SH3CA00008A,默克密理博实验室设备(上海)有限公司];0.22μm微孔滤膜(天津市津腾实验设备有限公司);RE-52旋转蒸发器(功率50W)、B220恒温水浴锅(功率1000W)(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 试剂与药物

6-姜酚(批号191115,纯度≥98%)、8-姜酚(批号200204,纯度≥98%)、10-姜酚(批号190513,纯度≥98%)对照品均由北京北纳创联生物技术研究院提供；诺卡酮(批号A10J10R79508,纯度≥98%)、杨芽黄素(批号Z17O8X44888,纯度≥98%)对照品均由上海源叶生物科技有限公司提供。乙腈为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司);其余试剂均为分析纯；水为超纯水。

益智仁(批号20190512,产地安徽)、干姜(批号20190904,产地安徽)、榧子(批号20200807,产地安徽)、白硇砂(批号20200322,产地新疆)均购自安徽省金芙蓉中药饮片有限公司；莲子(批号20200127,产地湖南)、荜茇(批号20190521,产地广西)均购自安徽中美堂中药饮片有限公司；冬葵果(批号20170768,产地河北)、苦石莲(批号20200207,产地四川)、方海(批号20200121,产地山东)均购自安国市彤康药业有限公司；麝香(批号20140704,产地河北)购自河北省菁草堂医药贸易有限公司),上述药材经内蒙古民族大学蒙医药学院鲍布日额教授鉴定为正品。

按《中华人民共和国卫生部药品标准》(蒙药分册1998)[18]记载，称取益智、方海各150g,干姜、白硇砂、荜茇、榧子、冬葵果、莲子、苦石莲各60g,麝香0.1g,制成苏格木勒-10(S11),其余11批(S1～S10、S12)购于10家医院制剂室，具体见表1。

2、方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚

AgilentC18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相水(含0.2%磷酸)(A)-乙腈(B),梯度洗脱(0～8.5min,30%～35%A,70%～65%B;8.5～10min,35%～30%A,65%～70%B;10～22min,30%A,70%B);体积流量0.8mL/min;柱温30℃;进样量5μL;检测波长205nm。

2.1.2 圆柚酮、杨芽黄素

AgilentC18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相水(含0.2%磷酸)(A)-乙腈(B),梯度洗脱(0～8.0min,30%～27%A,70%～73%B;8.0～12min,27%～22%A,73%～78%B;12～17min,22%～27%A,78%～73%B;17～20min,27%～30%A,73%～70%B);体积流量0.8mL/min;柱温30℃;检测波长238nm;进样量5μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液

取圆柚酮、杨芽黄素、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚对照品适量，置于25mL量瓶中，甲醇溶解定容，摇匀，得质量浓度分别为2000、2000、1000、2000、2000μg/mL的贮备液，再分别进一步稀释至200、200、103.13、200、200μg/mL,即得。

2.2.2 供试品溶液

精密称取全方(S11)粉末5g,置于200mL圆底烧瓶中，加75%甲醇100mL,超声(功率100W)处理30min,滤过，滤液减压浓缩，冷却至室温，甲醇定容至5mL,0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液

按全方工艺分别制备缺益智、缺干姜的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验

精密量取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果图1～2。由此可知，在该色谱条件下各成分均能达到基线分离，分离度均大于1.5,理论塔板数以6-姜酚峰计均不低于8000,阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

2.3.2 线性关系考察

精密称取对照品溶液0.25、0.50、1.0、2.0、4.0、5.0mL,置于10mL量瓶中，甲醇定容，摇匀，分别精密量取5μL,在“2.1”项色谱条件下进样测定。以各成分质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表2,可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验

取供试品溶液5μL,在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得圆柚酮、杨芽黄素、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚峰面积RSD分别为1.33%、1.47%、1.29%、2.14%、1.05%,表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验

取供试品溶液适量，室温下于0、2、4、6、8、10、24、36h在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得圆柚酮、杨芽黄素、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚峰面积RSD分别为1.11%、1.86%、2.50%、2.20%、1.92%、1.21%,表明溶液在36h内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验

取全方(S11)6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得圆柚酮、杨芽黄素、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚含量RSD分别为1.73%、1.12%、2.16%、1.76%、1.47%,表明该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验

取各成分含量已知的全方(S11)9份，每份2.5g,分别按1.5∶1、1∶1、0.5∶1比例加入对照品(圆柚酮793.5、529、264.5μg/g,杨芽黄素3.57、2.38、1.19μg/g,6-姜酚175.05、116.7、58.35μg/g,8-姜酚23.38、15.6、7.78μg/g,10-姜酚8.72、5.81、2.91μg/g),按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，圆柚酮、杨芽黄素、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚平均加样回收率分别为99.09%、88.72%、100.74%、96.80%、95.08%,RSD分别为0.84%、1.42%、1.11%、3.03%、1.12%。

2.3.7 样品含量测定

取12批全方(S1～S12),每份5g,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定3次，计算含量，结果见表3。

3、讨论与结论

本实验根据文献[13,19,20]对5种成分进行波长筛选，发现6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚在205nm处均有吸收峰，并且6-姜酚、8-姜酚有较大吸收，而圆柚酮、杨芽黄素在238nm处吸收较好。因此，在保证各成分检测灵敏度及基线分离的情况下，选择205、238nm作为检测波长。然后，考察了乙腈/甲醇与水/水(含磷酸)的组合，发现乙腈-水(含磷酸)的洗脱能力更优，并且磷酸体积分数为0.2%时无拖尾，故选择其作为流动相。再考察了75%甲醇、95%乙醇的提取效果，发现其中前者提取时峰面积、基线稳定性、噪声、分离度优于后者，而且超声提取相较于回流提取，具有峰面积大、基线平稳、噪声小、分离度理想、杂峰少、操作简便的优点。

含量测定结果显示，12批苏格木勒-10中圆柚酮、6-姜酚含量均较高，杨芽黄素、10-姜烯酚含量相当，8-姜酚含量均较低；S4中8-姜酚含量明显低于其他批次；S11中圆柚酮、10-姜酚含量最高；S7中杨芽黄素含量最高；S2中6-姜酚含量最高；S3中8-姜酚含量最高。虽然上述成分含量差异较大，但因它们为方中君药益智、使药干姜的主要活性成分[17,19,20,21],故仍将其作为检测指标。

综上所述，本实验首次建立HPLC法测定苏格木勒-10中圆柚酮、杨芽黄素、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的含量，该方法简便准确、专属性、重复性良好，检测成本低，可为完善和提高该方质量标准提供依据。

参考文献:

[1]宇妥·元丹贡布.四部医典[M].2版.赤峰:内蒙古科学技术出版社,1991:1039.

[2]嘎日玛·额力格丹森.月光医经[M].内蒙古中蒙医研究所,编译.呼和浩特:内蒙古人民出版社,1999:271.

[3]宝玉,韩光明.蒙药苏格木勒-10味治疗肾结石30例[J].中国民族医药杂志,2000,6(S1):12.

[4]王瑜,柯瑞君,蒋盼若,等.杨芽黄素对前列腺癌细胞凋亡的影响及其机制[J].中国应用生理学杂志,2019,35(3);283-288

[11]邵珠莹,潘金火,张月蝉,等.6-姜酚对马兜铃酸A诱导的HK-2肾小管上皮细胞损伤的保护作用[J].中成药,2020,42(10):2744-2747.

[12]覃秋语,吕祥威,武琦,等.6-姜酚预处理对乏氧/复氧诱导的H9C2心肌细胞损伤的保护作用[J].四川大学学报(医学版).2020,51(5).658-663.

[13]李冰.生姜挥发油成分分析及其主要活性成分6-姜酚的抗炎机制初步探究[D].沈阳:中国医科大学,2019.

[14]杨崇,傅若秋,高宁,等.8-姜酚抑制乳腺癌细胞增殖的分子机制研究[J].第三军医大学学报,2019,41(5):406-414.

[15]谷文光.6-姜酚增强VEGFa/VEGFR2结合增加血管渗透性抑制肿瘤演进[D].天津:南开大学,2017.

[17]张屏,赵·德力格尔呼,哈斯其木格,等.蒙药益智温肾十味丸质量标准[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(13);:75-78.