首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 药学论文 > 中药学论文 > 基于网络药理学和分子对接分析双莲方治疗肝细胞癌的作用机制

基于网络药理学和分子对接分析双莲方治疗肝细胞癌的作用机制

2022-02-09 716 上传者：管理员

摘要：目的使用网络药理学和分子对接方法,探讨双莲方治疗肝细胞癌(HCC)的潜在作用机制。方法在TCMSP平台筛选双莲方活性成分与靶点,使用GeneCards数据库得到HCC靶点。利用Cytoscape软件构建"中药-活性成分-靶点-疾病"网络和PPI网络,并使用Autodock软件进行分子对接。在DAVID数据库中进行GO和KEGG分析。结果得到47个活性成分和206个交集靶点,并筛选出7个核心活性成分和5个核心靶点。分子对接结果显示核心靶点均能与核心活性成分较好地结合。关键靶点主要调控RNA聚合酶II启动子转录的正调控、脂多糖介导的信号通路等生物过程,显著富集在乙肝通路、肿瘤坏死因子等信号通路。结论从活性成分、靶点、通路等方面分析双莲方治疗HCC的作用机制,为实验和临床研究提供基础。

关键词：
作用机制
信号通路
分子对接
网络药理学
肝细胞癌
靶点
加入收藏

肝细胞癌（HCC）是消化系统中常见的恶性肿瘤，占肝脏疾病的3%～4%和原发性肝癌的70%～90%，其发病率居世界第5位，病死率居第3位[1,2]。虽然HCC的诊疗水平日益提高，但患者症状较易反复，生存质量较低。

双莲方由半边莲、半枝莲、夏枯草组成，具有清热解毒、活血化瘀的功效，在治疗肝癌时应用广泛。但是双莲方治疗HCC的作用机制尚不明确，缺少从分子、通路等方面进行系统研究。网络药理学结合了基因和蛋白组学、生物信息学等多种理论及方法，可用于研究“药物、靶点、疾病”三者间复杂的交互作用关系[3]。本文通过使用网络药理学方法，从活性成分、靶点、通路、网络构建等方面对双莲方治疗HCC的作用机制进行研究，为双莲方治疗HCC提供基础。

1、材料与方法

1.1 筛选双莲方活性成分及靶点

在TCMSP数据库中，输入半边莲、半枝莲、夏枯草，以药物口服生物利用度（OB）≥30%和药物相似性（DL）≥0.18为条件进行检索，得到活性成分和靶蛋白。将靶蛋白输入“Uniprot”和“NCBI”数据库，得到对应的基因名称。

1.2 筛选HCC靶点

使用GeneCards数据库对“HCC”和“hepatocellularcarcinoma”进行检索，获得HCC靶点。

1.3 获取HCC与双莲方共同靶点

使用DrawVennDiagram对双莲方靶点及HCC靶点取交集，并绘制Venn图。

1.4 构建“中药-活性成分-靶点-疾病”网络图

使用Cytoscape3.7.2构建“中药-活性成分-靶点-疾病”网络图，再使用NetworkAnalyzer插件对该网络进行分析，满足连接度（Degree）大于平均值的活性成分为核心活性成分。

1.5 构建蛋白质-蛋白质互作（Protein-ProteinInter-action,PPI）网络

将交集靶点输入STRING11.0，得到PPI数据。使用Cytoscape3.7.2的NetworkAnalyzer插件对PPI数据进行拓扑分析，选取连接度（Degree）、中心介数（BetweennessCentrality）和中心度数（ClosenessCentrality）大于平均值的关键靶点再进行PPI分析，并使用cytoHubba插件中连接度（Degree）算法对关键靶点进行筛选，选取前5位为核心靶点。

1.6 分子对接

从ZINC和RCSBPDB数据库中下载核心活性成分和核心靶蛋白结构。使用Autodock4软件对核心活性成分和核心靶蛋白进行分子对接，选择算法为拉马克遗传算法（GeneticAlgorithm），得到结合自由能(bindingenergy）。

1.7 GO及KEGG分析

将关键靶点输入DAVID6.8，筛选满足P<0.05的GO和KEGG条目为显著富集条目，其中GO分析包括生物过程（BP）、细胞定位（CC）和分子功能（MF）分析。

2、结果

2.1 筛选活性成分及靶点

使用TCMSP检索出双莲方的活性成分，其中包括半边莲71个、半枝莲94个、夏枯草60个，符合OB≥30%、DL≥0.18并对应靶点的有48个活性成分，对应243个靶点。

2.2 筛选HCC靶点

通过Genecards数据库分析，得到6910个HCC靶点。

2.3 筛选双莲方和HCC交集靶点

通过DrawVennDiagram分析，得到206个交集靶点。见图1。

2.4 “中药-活性成分-靶点-疾病”网络图

在Cytoscape中构建“中药-活性成分-靶点-疾病”网络图。使用NetworkAnalyzer对网络进行分析，得到活性成分的平均连接度为25.82978723，其中7个活性成分的连接度大于平均连接度为核心活性成分，包括槲皮素（quercetin，连接度=409）、木犀草素（luteolin，连接度=168）、山奈酚（kaempferol，连接度=107）、β-谷甾醇（beta-sitosterol，连接度=50）、豆甾醇（stigmasterol，连接度=43）、汉黄芩素（wogonin，连接度=40）和黄芩素（baicalein，连接度=34）。见图2。

2.5 PPI网络的构建

使用Cytoscape3.7.2的NetworkAnalyzer插件分析交集靶点的PPI数据，得到连接度平均值为40.42156866、中心介数平均值为0.00159226和中心度数平均值为0.528280539，其中71个靶点的连接度、中心介数和中心度数大于平均值为关键靶点。对关键靶点进行PPI分析，筛选出5个核心靶点，分别为蛋白激酶Bα（proteinkinaseBα，AKT1，连接度=70）、肿瘤蛋白p53(tumorproteinp53,TP53，连接度=70）、血管内皮生成因子A(vascularendothelialgrowthfactorA,VEGFA，连接度=70）、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase3,CASP3，连接度=68）、原癌基因jun(junproto-oncogene,JUN，连接度=68）。见图3。

2.6 分子对接结果

使用Autodock4软件进行分子对接，得到结合自由能。当结合自由能<0kcal/mol时，表示活性成分可与靶点自发结合，结合自由能越小，两者的结合能力越强。对接结果显示，结合自由能均在（-4.13～-6.89)kcal/mol之间，说明核心靶蛋白均能与核心活性成分较好地结合。见表1。

2.7 GO和KEGG分析

GO和KEGG分析显示，关键靶点显著富集在RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、脂多糖介导的信号通路、血管生成、内皮细胞凋亡的负调节等89个BP条目，分布在细胞外间隙、细胞核和胞浆等16个CC条目，参与蛋白质结合、DNA结合、转录因子活性等27种MF条目，显著富集在癌症信号通路、乙肝（HepatitisB）、肿瘤坏死因子（TNF）、蛋白聚糖癌症通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt）、p53等89条KEGG通路。

3、讨论

网络药理学能够从成分、靶点、通路等方面系统分析药物治疗疾病的作用机制，为研究中医药治疗疾病提供新方法。

本文得到47个双莲方治疗HCC的活性成分，其中包括7个核心活性成分，分别为槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、汉黄芩素、黄芩素。研究发现，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇和黄芩素均能降低肝癌细胞增殖能力、促进其凋亡的发生和引起细胞周期阻滞[4,5,6,7]。木犀草素和汉黄芩素可抑制肝癌细胞的侵袭、迁移和黏附能力，并且木犀草素可减少细胞增殖，汉黄芩素可诱导细胞凋亡[8,9,10]。

通过PPI分析得到71个关键靶点和5个核心靶点，包括AKT1、TP53、VEGFA、CASP3、JUN。研究发现AKT1及磷酸化AKT1在大鼠肝癌组织中表达上调，并与脱氧核糖核酸甲基转移酶3B(DNMT3B）共同诱导肝癌的产生[11]。TP53，又名p53，在原发性肝癌组织中高表达且与低生存率、高TNM分级、高病理分级呈正相关[12]。VEGFA为血管生成因子，在肝癌细胞中高表达，其启动子单核酸多态性（SNPs）可能通过改变启动子活性导致HCC的易感性[13]。Caspase3在HCC组织中表达降低并与低分化程度密切相关[14]。JUN是编码c-JUN蛋白的致癌基因，过表达的c-JUN可增加肝癌细胞的侵袭和迁移能力[15]。KEGG分析显示，关键靶点主要富集在HepatitisB、TNF、蛋白聚糖癌症通路、PI3K-Akt、p53等信号通路。

综上所述，本文通过使用网络药理学方法，分析出双莲方治疗HCC的活性成分、关键靶点和信号通路，并使用分子对接方法验证了核心活性成分和核心靶点能够相互作用，揭示了双莲方治疗HCC具有多成分、多靶点、多通路的机制特点，为实验或临床研究提供基础。

参考文献:

[3]解静,高杉,李琳,等.网络药理学在中药领域中的研究进展与应用策略[J].中草药,2019,50(10):2257-2265.

[4]张玉洁,曹军华,吴倩,等.棚皮素对人肝癌SMMC-7721细胞增殖和凋亡及其凋亡通路的影响[J].中医药导报,2013,19(5):93-95.

[5]王铮华,梁统,李涛,等.山亲酚对人肝癌细胞Huh7生长及凋亡的影响[J].广东医学,2014,35(2):192-194.

[6]李庆勇,姜春菲,张黎,等.β-谷甾醇､豆甾醇诱导人肝癌细胞SMMC-7721洞亡[J].时珍国医国药,2012,23(5):1173-1175.

[7]周珍,刘少平,周朗,等.黄芩素通过PI3KIAKT通路增强三氧化二砷对肝癌细胞的促凋亡作用[J].现代肿瘤医学,2019,27(10):1661-1668.

[8]李春雨,王琪,申珅,等.木犀草素对人肝癌HepG2细胞株侵袭､迁移和黏附能力的影响[J].中国病理生理杂志,2017,33(9):1606-1610.

[9]李霞,封英娟,王正根,等.木犀草素通过抑制肝癌细胞Sp1活性上调抑癌基因OPCML表达[J].基因组学与应用生物学,2017,36(7):2619-2626.

[10]苏飞,赵达,庄亚飞,等.汉黄芩素对肝癌细胞SMMC-7721增殖､迁移及侵袭的影响[J].中华实用诊断与治疗杂志,2017,31(8).735-738.

[12]贺伟,母齐鸣,王刚,等.TACC3和p53蛋白在原发性肝癌组织中的表达及其临床意义[J].实用肿瘤学杂志,2018,32(5).420-425.

[14]彭绍华,杨剑锋,谢平平,等.肝细胞肝癌组织中survivin和caspase3､Ki67的表达及意义[J].肿瘤,2005,25(3);243-245,253.