摘要:目的观察芍药苷(PF)对高糖环境下雪旺细胞线粒体动力学的影响。方法选取大鼠雪旺细胞(RSC96细胞株)培养,分为空白对照组(Con,25mmol/L葡萄糖)、高糖组(HG,150mmol/L葡萄糖)、PF1μmol/L组(PF1,150mmol/L葡萄糖+1μmol/LPF)、PF10μmol/L组(PF10,150mmol/L葡萄糖+10μmol/LPF)、PF100μmol/L组(PF100,150mmol/L葡萄糖+100μmol/LPF),各组药物干预48h。透射电镜观察线粒体形态,包括融合、分裂、溶胀、破裂等。Mitotracker-green标记线粒体联合活细胞激光扫描共聚焦显微镜,定量分析线粒体动力学参数,包括线粒体网状结构的平均分支长度和平均分支数。Westernblot测定线粒体融合蛋白1(Mfn1)、Mfn2、视网膜萎缩蛋白1(Opa1)及线粒体分裂的动力相关蛋白1(Drp1)蛋白表达。结果与Con组比较,HG组线粒体多呈球状,线粒体网状结构的平均分支长度和数量减少(P<0.01),Mfn1、Mfn2和Opa1蛋白表达降低(P<0.01),Drp1蛋白表达升高(P<0.01);与HG组比较,PF1、PF10、PF100组线粒体多呈棍状,线粒体网状结构平均分支长度和数量增加(P<0.01),Mfn1,Mfn2和Opa1蛋白表达升高(P<0.05或P<0.01),Drp1蛋白表达降低(P<0.05或P<0.01)。结论PF能促进高糖环境下雪旺细胞线粒体融合,降低分裂,维持线粒体动力学平衡,改善线粒体形态与功能,降低雪旺细胞凋亡。
2019年国际糖尿病联盟预测,DM已成为21世纪最大的全球性流行病,约4.25亿人患病,其中超过50%的DM可发展为糖尿病周围神经病变(DPN)[1]。DPN可引起神经性疼痛和足部溃疡,是造成腿部截肢的主要原因,严重降低患者生活质量,增加DM死亡率。目前除改善生活方式和控制DM外,仍缺乏针对发病机制治疗方法[2,3]。
DPN主要病理改变为脱髓鞘,雪旺细胞是周围神经系统髓鞘形成细胞,在维持周围神经结构和功能方面起重要作用[4]。高血糖氧化应激诱导雪旺细胞病变是DPN主要发病机制[5]。雪旺细胞病变是指髓鞘形成蛋白受抑制、氧化损伤、凋亡等。研究[6]表明,芍药苷(PF)有降低血糖、抗氧化、减轻神经炎症和疼痛等功效,在治疗DPN中有潜在应用价值。前期研究[7]证实,PF有明确抗氧化应激作用,能上调核因子E2相关因子2/抗氧化反应元件内源性抗氧化应激途径中血红素氧合酶1、γ‐谷氨酰半胱氨酸合成酶,降低高糖环境下雪旺细胞活性氧簇(ROS)生成,减轻氧化应激、抑制线粒体凋亡途径中Bcl‐2相关X蛋白、细胞色素C和Caspase‐3表达,改善线粒体功能,降低雪旺细胞凋亡。
研究[8]表明,线粒体动力学平衡变化,即线粒体分裂、融合运动,影响线粒体功能。研究[9]发现,直接参与线粒体融合和分裂的蛋白主要包括线粒体融合蛋白1(Mfn1)、Mfn2、视神经萎缩蛋白1(Opa1)和动力相关蛋白1(Drp1)。研究[10]证实,线粒体动力学蛋白表达异常参与周围神经病变,如进行性腓骨肌萎缩症,其病变主要包括轴突萎缩和雪旺细胞病变造成的脱髓鞘,与DPN病理改变相似。此外,线粒体动力学异常还参与DM发生发展[11]。PF能否作用于高糖环境下雪旺细胞线粒体动力学未见报道。本研究通过以线粒体动力学为切入点,探讨PF干预高糖环境下雪旺细胞的作用机制,旨在为阐明其干预DPN的分子机制提供依据。
一、材料与方法
1. 实验材料
RSC96细胞株(CL‐0199)购自武汉普诺赛生命科技有限公司,DMEM完全培养基(含4mmol/L谷氨酰胺,1mmol/L丙酮酸钠,4500mg/LD‐葡萄糖,3700mg/L碳酸氢钠,10%FBS,15mg/L酚红及1%青链霉素混合液)于37℃和5%CO2细胞培养箱培养。
PF(B21148,上海源叶生物科技有限公司),MitoTrackerTMGreenFM(M7154)、线粒体分离试剂盒(89874,美国ThermoScientific公司),Mfn1(OM209507,美国Omnimabs公司),Mfn2(ab124773)、OPA1(ab157457)、Drp1(ab184247)(英国Abcam公司),DMEM(11965‐092)、胎牛血清(10099‐141)、0.25%Trypsin‐EDTA(25200‐056)(美国Gibco公司),D‐(+)‐Glucose(D7021)、DMSO(D2650‐100ML)(美国Sigma公司),PhosSTOP(4906845001),cOmplete,EDTA‐feeProteaseInhibitorCocktail(4693132001)(瑞士Roche公司),青链霉素混合液(100×)(P1400)、4×蛋白上样缓冲液(含DTT)(P1015)(北京索莱宝科技有限公司),SDS‐PAGE凝胶配置试剂盒(P0012A,碧云天),ExcelBandTMEnhanced3‐colorRegularRangeProteinMarker(P2510,安诺伦)。
AC2‐4E1二级生物安全柜(新加坡Esco公司),INC153二氧化碳培养箱(德国Memmert公司),TD‐5Z低速离心机(四川蜀科仪器),ULT‐2186‐4‐V49超低温冰箱(美国ThermoFisher公司),3K15低温离心机(德国Sigma公司),MixMate混匀小精灵(德国Eppendorf公司),SpectraMax®iD3多功能酶标仪(美国MolecularDevies公司),UW3100超声细胞破碎仪(德国Bandelin公司),PowerPac™基础电泳仪电源、Mini‐PROTEAN®Tetra电泳槽、Trans‐Blot®转印槽(美国Bio‐Rad公司),TS‐200脱色摇床(江苏其林贝尔),FUSIONFX凝胶&化学发光成像分析系统(法国Vilber公司),HT7700透射电子显微镜(日本HITACHI公司),880Airyscan高分辨共聚焦显微镜(德国ZEISS公司)。
2. 实验方法
2.1 细胞培养与分组:取对数生长期RSC96细胞制成细胞悬液并计算浓度,用DMEM完全培养基将细胞悬液稀释至1×105/ml,按10ml/皿接种于10cm细胞培养皿中,贴壁24h。吸弃培养基,分为空白对照组(Con,25mmol/L葡萄糖)、高糖组(HG,150mmol/L葡萄糖)、PF1μmol/L组(PF1,150mmol/L葡萄糖+1μmol/LPF)、PF10μmol/L组(PF10,150mmol/L葡萄糖+10μmol/LPF)、PF100μmol/L组(PF100,150mmol/L葡萄糖+100μmol/LPF),细胞培养箱中孵育48h[7]。
2.2 透射电镜观察线粒体超微结构:各组吸弃培养基,加入1ml胰酶消化1min,吸弃胰酶。加入3mlDMEM完全培养基吹打至细胞从培养皿上完全脱落,反复吹打混合均匀,制成细胞悬液。将细胞悬液3300r离心5min,吸弃上清。缓慢加入2mlGluta固定液,不吹散细胞,固定2h。吸弃固定液,缓慢加入0.1mol/LPB缓冲液4ml,样本送至首都医科大学中心实验室形态学研究平台电子显微镜室,JEM‐2100透射电子显微镜观察线粒体形态。
2.3 线粒体动力学参数测定:取对数生长期RSC96细胞制成细胞悬液,稀释至1×104/ml,按0.3ml/孔接种于腔室盖玻片上,贴壁24h。参照细胞培养与分组部分进行药物干预。吸弃培养基,每孔加入0.3ml37℃预温的200nmol/LMitoTracker®GreenFM探针工作液,CO2培养箱中孵育45min。从CO2培养箱中取出腔室盖玻片,吸弃探针工作液,用37℃预温的DMEM完全培养基代替染色液,送至首都医科大学中心实验室形态学研究平台共聚焦显微镜室,880Airyscan高分辨共聚焦显微镜观察线粒体形态。基于电脑软件Imagej的宏MINA统计线粒体网状结构平均分支长度,平均分支数[12]。每组随机选取30个细胞进行分析。
2.4 细胞线粒体分离及蛋白提取:取对数生长期RSC96细胞制成细胞悬液进行细胞计数,按照4×106/瓶接种于75cm2细胞培养瓶中,贴壁24h。吸弃培养基,进行细胞消化、收集细胞。细胞悬液于3000r离心2min,重悬细胞,进行细胞计数。根据线粒体分离试剂盒说明书,以每样本2×107个细胞进行线粒体分离操作。将100μl含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的20%丙磺酸内盐(CHAPS)/Tris加入线粒体样本中,使用细胞超声破碎仪提取蛋白。4℃下11500r离心15min,取90μl上清保存,待进行Westernblot实验,其余测定蛋白含量。
2.5 Westernblot法测定蛋白表达:将线粒体蛋白上清液与含DTT的4×蛋白上样缓冲液按体积比3:1比例混合均匀,于沸水中煮7min使蛋白变性,冷却后20μl/管分装,-80℃保存。按照SDS‐PAGE凝胶配置试剂盒说明书要求,根据目的蛋白分子量选择10%凝胶浓度。电泳后进行转模,PVDF膜用BSA室温孵育2h进行封闭后,一抗4℃孵育过夜(约16h)。吸弃一抗,用1×TBST洗涤液于摇床上震荡洗膜5min,共4次。加入5ml用1×TBST稀释二抗,室温摇床震荡孵育1h。吸弃二抗,用1×TBST洗涤液于摇床上震荡洗膜5min,共4次。将膜正面朝上放在自封袋上,按LuminolReagent与PeroxideSolution1:1体积比准备发光液,充分混匀,发光液用量为0.1ml/cm2PVDF膜。将发光液缓慢均匀滴加在膜正面,盖上自封袋去除气泡。使用凝胶化学发光系统进行曝光并按需要格式保存图片。采用ImageJ软件对图片进行分析获取灰度值。
3. 统计学处理
采用GraphPadPrism7.0软件进行统计学分析。正态分布计量资料以表示,多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.01或P<0.05为差异有统计学意义。
二、结果
1. 各组线粒体结构比较
Con组线粒体大多呈杆形,少数呈偏球形。HG组线粒体大多呈球形,部分呈分裂状。PF1、PF10、PF100组线粒体状态较HG组好转,线粒体大多呈杆状。(图1)
2. 各组线粒体动力学参数比较
与Con组比较,HG组线粒体网状结构平均分支长度和数量减少(P<0.01)。与HG组比较,PF1、PF10和PF100组线粒体网状结构平均分支长度和数量增加(P<0.01)。(图2)
3. Westernblot检测各组线粒体动力学相关蛋白表达比较
与Con组比较,HG组Mfn1、Mfn2和Opal蛋白表达降低(P<0.01),Drpl蛋白表达升高(P<0.01)。与HG组比较,PF1、PF10和PF100组Mfn1、Mfi2和Opal蛋白表达升高(P<0.05或P<0.01),Drpl蛋白表达降低P<0.01)。(图3)
三、讨论
高糖环境下,己糖胺途径、多元醇途径、蛋白激酶C亚型、AGEs等激活,这些通路共同导致ROS过度形成,损伤线粒体,引起线粒体功能障碍,最终导致DPN[13]。有研究[14]报道,高糖环境导致的渗透压改变无法对雪旺细胞活性造成影响。线粒体是ROS主要生成场所。线粒体在细胞内彼此连接,频繁发生融合与分裂,保持动态平衡状态,称为线粒体动力学,通过控制线粒体结构(形态、数量)调控其功能(细胞内ROS生成、物质合成和分配、细胞信号通路以及凋亡、自噬等)[8]。
研究[15]表明,高糖环境下,发生轻微氧化应激时,细胞中线粒体可通过将2个线粒体高度融合中和受损蛋白,缓解线粒体应激,或通过不对称线粒体分裂,将具有低电势、受损部分线粒体通过自噬消除。持续氧化应激将触发过度的线粒体分裂和/或融合,造成融合/分裂失衡,引起线粒体功能异常,包括线粒体DNA减少,ATP合成降低,线粒体膜电势(MMP)降低(膜完整性受损)等,最终触发线粒体凋亡途径,诱导细胞凋亡[15]。
直接参与融合和分裂的蛋白主要包括4个,其中线粒体融合主要涉及定位于线粒体外膜(OMMs)的Mfn1,Mfn2和定位于线粒体内膜(IMMs)的Opa1。在分子水平,线粒体融合分2步完成,先是OMMs融合,然后是IMMs融合。线粒体间通过形成Mfn1‐Mfn2或Mfn2‐Mfn2使OMMs融合。Opa1存在聚积在内膜的全长Opa1(L‐Opa1)和定位膜间的剪切型Opa1(S‐Opa1)的2种形式,L‐Opa1和S‐Opa1形成平衡是维持线粒体结构正常的关键。线粒体分裂由Drp1调控,细胞质中Drp1募集至线粒体外膜与外膜上受体结合,通过收缩线粒体最终将其分裂[9]。本研究中PF能增加Mfn1、Mfn2和Opa1表达,降低Drp1表达。前期研究[7]表明,PF能增加MMP,进一步证实PF通过增加线粒体融合的同时降低线粒体分裂,维持线粒体动力学平衡,改善线粒体功能。
本研究中观察线粒体超微结构显示,HG组雪旺细胞中线粒体可能分裂,而芍药苷能降低分裂,增加线粒体融合。线粒体分支长度和数量能反映融合线粒体长度和数量,通过激光共聚焦显微镜观察线粒体结构,显示芍药苷能增加线粒体融合。蛋白表达检测结果表明,芍药苷增加高糖环境下雪旺细胞线粒体融合的同时降低分裂。
研究[16]表明,Nrf2通过线粒体DNA调节线粒体生成和动力学。前期研究[7]证实,PF上调Nrf2表达,降低ROS含量,发挥氧化应激作用,提示PF维持线粒体动力学平衡与其降低氧化应激作用相关。高糖环境诱导氧化应激是雪旺细胞凋亡、脱髓鞘、引起DPN的主要发病机制[17]。
综上所述,PF通过维持线粒体动力学平衡,改善线粒体功能和结果,降低氧化应激,具备干预DPN的潜在价值。
参考文献:
[6]邢琪昌,陈佳,李伟,等.基于网络药理学研究芍药苷治疗糖尿病周围神经病变作用机制[J].中国药理学与毒理学杂志,2019,33:725.
[14]孙连庆,王煊,李晓瑾,等.丹参酮ⅡA抑制波动性高糖诱导的雪旺细胞凋亡的观察[J].中国糖尿病杂志,2015,23:1027-1031.
文章来源:朱晏伯,李潇,朱笳悦,许利平,杨鑫伟.芍药苷对高糖环境下雪旺细胞线粒体动力学的影响[J].中国糖尿病杂志,2022,30(03):214-220.
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