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芍药苷对高糖环境下雪旺细胞线粒体动力学的影响

2022-03-10 166 上传者：管理员

摘要：目的观察芍药苷（PF）对高糖环境下雪旺细胞线粒体动力学的影响。方法选取大鼠雪旺细胞（RSC96细胞株）培养,分为空白对照组（Con,25mmol/L葡萄糖）、高糖组（HG,150mmol/L葡萄糖）、PF1μmol/L组（PF1,150mmol/L葡萄糖+1μmol/LPF）、PF10μmol/L组（PF10,150mmol/L葡萄糖+10μmol/LPF）、PF100μmol/L组（PF100,150mmol/L葡萄糖+100μmol/LPF）,各组药物干预48h。透射电镜观察线粒体形态,包括融合、分裂、溶胀、破裂等。Mitotracker-green标记线粒体联合活细胞激光扫描共聚焦显微镜,定量分析线粒体动力学参数,包括线粒体网状结构的平均分支长度和平均分支数。Westernblot测定线粒体融合蛋白1（Mfn1）、Mfn2、视网膜萎缩蛋白1（Opa1）及线粒体分裂的动力相关蛋白1（Drp1）蛋白表达。结果与Con组比较,HG组线粒体多呈球状,线粒体网状结构的平均分支长度和数量减少（P<0.01）,Mfn1、Mfn2和Opa1蛋白表达降低（P<0.01）,Drp1蛋白表达升高（P<0.01）;与HG组比较,PF1、PF10、PF100组线粒体多呈棍状,线粒体网状结构平均分支长度和数量增加（P<0.01）,Mfn1,Mfn2和Opa1蛋白表达升高（P<0.05或P<0.01）,Drp1蛋白表达降低（P<0.05或P<0.01）。结论PF能促进高糖环境下雪旺细胞线粒体融合,降低分裂,维持线粒体动力学平衡,改善线粒体形态与功能,降低雪旺细胞凋亡。

关键词：
生活质量
糖尿病周围神经病变
线粒体动力学
芍药苷
雪旺细胞
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2019年国际糖尿病联盟预测，DM已成为21世纪最大的全球性流行病，约4.25亿人患病，其中超过50%的DM可发展为糖尿病周围神经病变（DPN)[1]。DPN可引起神经性疼痛和足部溃疡，是造成腿部截肢的主要原因，严重降低患者生活质量，增加DM死亡率。目前除改善生活方式和控制DM外，仍缺乏针对发病机制治疗方法[2,3]。

DPN主要病理改变为脱髓鞘，雪旺细胞是周围神经系统髓鞘形成细胞，在维持周围神经结构和功能方面起重要作用[4]。高血糖氧化应激诱导雪旺细胞病变是DPN主要发病机制[5]。雪旺细胞病变是指髓鞘形成蛋白受抑制、氧化损伤、凋亡等。研究[6]表明，芍药苷（PF）有降低血糖、抗氧化、减轻神经炎症和疼痛等功效，在治疗DPN中有潜在应用价值。前期研究[7]证实，PF有明确抗氧化应激作用，能上调核因子E2相关因子2/抗氧化反应元件内源性抗氧化应激途径中血红素氧合酶1、γ‐谷氨酰半胱氨酸合成酶，降低高糖环境下雪旺细胞活性氧簇（ROS）生成，减轻氧化应激、抑制线粒体凋亡途径中Bcl‐2相关X蛋白、细胞色素C和Caspase‐3表达，改善线粒体功能，降低雪旺细胞凋亡。

研究[8]表明，线粒体动力学平衡变化，即线粒体分裂、融合运动，影响线粒体功能。研究[9]发现，直接参与线粒体融合和分裂的蛋白主要包括线粒体融合蛋白1(Mfn1）、Mfn2、视神经萎缩蛋白1(Opa1）和动力相关蛋白1(Drp1）。研究[10]证实，线粒体动力学蛋白表达异常参与周围神经病变，如进行性腓骨肌萎缩症，其病变主要包括轴突萎缩和雪旺细胞病变造成的脱髓鞘，与DPN病理改变相似。此外，线粒体动力学异常还参与DM发生发展[11]。PF能否作用于高糖环境下雪旺细胞线粒体动力学未见报道。本研究通过以线粒体动力学为切入点，探讨PF干预高糖环境下雪旺细胞的作用机制，旨在为阐明其干预DPN的分子机制提供依据。

一、材料与方法

1. 实验材料

RSC96细胞株（CL‐0199）购自武汉普诺赛生命科技有限公司，DMEM完全培养基（含4mmol/L谷氨酰胺，1mmol/L丙酮酸钠，4500mg/LD‐葡萄糖，3700mg/L碳酸氢钠，10%FBS,15mg/L酚红及1%青链霉素混合液）于37℃和5%CO2细胞培养箱培养。

PF(B21148，上海源叶生物科技有限公司），MitoTrackerTMGreenFM(M7154）、线粒体分离试剂盒（89874，美国ThermoScientific公司），Mfn1(OM209507，美国Omnimabs公司），Mfn2(ab124773）、OPA1(ab157457）、Drp1(ab184247）（英国Abcam公司），DMEM(11965‐092）、胎牛血清（10099‐141）、0.25%Trypsin‐EDTA(25200‐056）（美国Gibco公司），D‐（+）‐Glucose(D7021）、DMSO(D2650‐100ML）（美国Sigma公司），PhosSTOP(4906845001),cOmplete,EDTA‐feeProteaseInhibitorCocktail(4693132001）（瑞士Roche公司），青链霉素混合液（100×）（P1400）、4×蛋白上样缓冲液（含DTT)(P1015）（北京索莱宝科技有限公司），SDS‐PAGE凝胶配置试剂盒（P0012A，碧云天），ExcelBandTMEnhanced3‐colorRegularRangeProteinMarker(P2510，安诺伦）。

AC2‐4E1二级生物安全柜（新加坡Esco公司），INC153二氧化碳培养箱（德国Memmert公司），TD‐5Z低速离心机（四川蜀科仪器），ULT‐2186‐4‐V49超低温冰箱（美国ThermoFisher公司），3K15低温离心机（德国Sigma公司），MixMate混匀小精灵（德国Eppendorf公司），SpectraMax®iD3多功能酶标仪（美国MolecularDevies公司），UW3100超声细胞破碎仪（德国Bandelin公司），PowerPac™基础电泳仪电源、Mini‐PROTEAN®Tetra电泳槽、Trans‐Blot®转印槽（美国Bio‐Rad公司），TS‐200脱色摇床（江苏其林贝尔），FUSIONFX凝胶&化学发光成像分析系统（法国Vilber公司），HT7700透射电子显微镜（日本HITACHI公司），880Airyscan高分辨共聚焦显微镜（德国ZEISS公司）。

2. 实验方法

2.1 细胞培养与分组：取对数生长期RSC96细胞制成细胞悬液并计算浓度，用DMEM完全培养基将细胞悬液稀释至1×105/ml，按10ml/皿接种于10cm细胞培养皿中，贴壁24h。吸弃培养基，分为空白对照组（Con,25mmol/L葡萄糖）、高糖组（HG,150mmol/L葡萄糖）、PF1μmol/L组（PF1,150mmol/L葡萄糖+1μmol/LPF）、PF10μmol/L组（PF10,150mmol/L葡萄糖+10μmol/LPF）、PF100μmol/L组（PF100,150mmol/L葡萄糖+100μmol/LPF），细胞培养箱中孵育48h[7]。

2.2 透射电镜观察线粒体超微结构：各组吸弃培养基，加入1ml胰酶消化1min，吸弃胰酶。加入3mlDMEM完全培养基吹打至细胞从培养皿上完全脱落，反复吹打混合均匀，制成细胞悬液。将细胞悬液3300r离心5min，吸弃上清。缓慢加入2mlGluta固定液，不吹散细胞，固定2h。吸弃固定液，缓慢加入0.1mol/LPB缓冲液4ml，样本送至首都医科大学中心实验室形态学研究平台电子显微镜室，JEM‐2100透射电子显微镜观察线粒体形态。

2.3 线粒体动力学参数测定：取对数生长期RSC96细胞制成细胞悬液，稀释至1×104/ml，按0.3ml/孔接种于腔室盖玻片上，贴壁24h。参照细胞培养与分组部分进行药物干预。吸弃培养基，每孔加入0.3ml37℃预温的200nmol/LMitoTracker®GreenFM探针工作液，CO2培养箱中孵育45min。从CO2培养箱中取出腔室盖玻片，吸弃探针工作液，用37℃预温的DMEM完全培养基代替染色液，送至首都医科大学中心实验室形态学研究平台共聚焦显微镜室，880Airyscan高分辨共聚焦显微镜观察线粒体形态。基于电脑软件Imagej的宏MINA统计线粒体网状结构平均分支长度，平均分支数[12]。每组随机选取30个细胞进行分析。

2.4 细胞线粒体分离及蛋白提取：取对数生长期RSC96细胞制成细胞悬液进行细胞计数，按照4×106/瓶接种于75cm2细胞培养瓶中，贴壁24h。吸弃培养基，进行细胞消化、收集细胞。细胞悬液于3000r离心2min，重悬细胞，进行细胞计数。根据线粒体分离试剂盒说明书，以每样本2×107个细胞进行线粒体分离操作。将100μl含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的20%丙磺酸内盐（CHAPS）/Tris加入线粒体样本中，使用细胞超声破碎仪提取蛋白。4℃下11500r离心15min，取90μl上清保存，待进行Westernblot实验，其余测定蛋白含量。

2.5 Westernblot法测定蛋白表达：将线粒体蛋白上清液与含DTT的4×蛋白上样缓冲液按体积比3:1比例混合均匀，于沸水中煮7min使蛋白变性，冷却后20μl/管分装，-80℃保存。按照SDS‐PAGE凝胶配置试剂盒说明书要求，根据目的蛋白分子量选择10%凝胶浓度。电泳后进行转模，PVDF膜用BSA室温孵育2h进行封闭后，一抗4℃孵育过夜（约16h）。吸弃一抗，用1×TBST洗涤液于摇床上震荡洗膜5min，共4次。加入5ml用1×TBST稀释二抗，室温摇床震荡孵育1h。吸弃二抗，用1×TBST洗涤液于摇床上震荡洗膜5min，共4次。将膜正面朝上放在自封袋上，按LuminolReagent与PeroxideSolution1:1体积比准备发光液，充分混匀，发光液用量为0.1ml/cm2PVDF膜。将发光液缓慢均匀滴加在膜正面，盖上自封袋去除气泡。使用凝胶化学发光系统进行曝光并按需要格式保存图片。采用ImageJ软件对图片进行分析获取灰度值。

3. 统计学处理

采用GraphPadPrism7.0软件进行统计学分析。正态分布计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.01或P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1. 各组线粒体结构比较

Con组线粒体大多呈杆形，少数呈偏球形。HG组线粒体大多呈球形，部分呈分裂状。PF1、PF10、PF100组线粒体状态较HG组好转，线粒体大多呈杆状。（图1)

2. 各组线粒体动力学参数比较

与Con组比较，HG组线粒体网状结构平均分支长度和数量减少（P<0.01）。与HG组比较，PF1、PF10和PF100组线粒体网状结构平均分支长度和数量增加（P<0.01）。（图2)

3. Westernblot检测各组线粒体动力学相关蛋白表达比较

与Con组比较，HG组Mfn1、Mfn2和Opal蛋白表达降低（P<0.01),Drpl蛋白表达升高(P<0.01）。与HG组比较，PF1、PF10和PF100组Mfn1、Mfi2和Opal蛋白表达升高（P<0.05或P<0.01),Drpl蛋白表达降低P<0.01）。（图3)

三、讨论

高糖环境下，己糖胺途径、多元醇途径、蛋白激酶C亚型、AGEs等激活，这些通路共同导致ROS过度形成，损伤线粒体，引起线粒体功能障碍，最终导致DPN[13]。有研究[14]报道，高糖环境导致的渗透压改变无法对雪旺细胞活性造成影响。线粒体是ROS主要生成场所。线粒体在细胞内彼此连接，频繁发生融合与分裂，保持动态平衡状态，称为线粒体动力学，通过控制线粒体结构（形态、数量）调控其功能（细胞内ROS生成、物质合成和分配、细胞信号通路以及凋亡、自噬等）[8]。

研究[15]表明，高糖环境下，发生轻微氧化应激时，细胞中线粒体可通过将2个线粒体高度融合中和受损蛋白，缓解线粒体应激，或通过不对称线粒体分裂，将具有低电势、受损部分线粒体通过自噬消除。持续氧化应激将触发过度的线粒体分裂和/或融合，造成融合/分裂失衡，引起线粒体功能异常，包括线粒体DNA减少，ATP合成降低，线粒体膜电势（MMP）降低（膜完整性受损）等，最终触发线粒体凋亡途径，诱导细胞凋亡[15]。

直接参与融合和分裂的蛋白主要包括4个，其中线粒体融合主要涉及定位于线粒体外膜（OMMs）的Mfn1,Mfn2和定位于线粒体内膜（IMMs）的Opa1。在分子水平，线粒体融合分2步完成，先是OMMs融合，然后是IMMs融合。线粒体间通过形成Mfn1‐Mfn2或Mfn2‐Mfn2使OMMs融合。Opa1存在聚积在内膜的全长Opa1(L‐Opa1）和定位膜间的剪切型Opa1(S‐Opa1）的2种形式，L‐Opa1和S‐Opa1形成平衡是维持线粒体结构正常的关键。线粒体分裂由Drp1调控，细胞质中Drp1募集至线粒体外膜与外膜上受体结合，通过收缩线粒体最终将其分裂[9]。本研究中PF能增加Mfn1、Mfn2和Opa1表达，降低Drp1表达。前期研究[7]表明，PF能增加MMP，进一步证实PF通过增加线粒体融合的同时降低线粒体分裂，维持线粒体动力学平衡，改善线粒体功能。

本研究中观察线粒体超微结构显示，HG组雪旺细胞中线粒体可能分裂，而芍药苷能降低分裂，增加线粒体融合。线粒体分支长度和数量能反映融合线粒体长度和数量，通过激光共聚焦显微镜观察线粒体结构，显示芍药苷能增加线粒体融合。蛋白表达检测结果表明，芍药苷增加高糖环境下雪旺细胞线粒体融合的同时降低分裂。

研究[16]表明，Nrf2通过线粒体DNA调节线粒体生成和动力学。前期研究[7]证实，PF上调Nrf2表达，降低ROS含量，发挥氧化应激作用，提示PF维持线粒体动力学平衡与其降低氧化应激作用相关。高糖环境诱导氧化应激是雪旺细胞凋亡、脱髓鞘、引起DPN的主要发病机制[17]。

综上所述，PF通过维持线粒体动力学平衡，改善线粒体功能和结果，降低氧化应激，具备干预DPN的潜在价值。

参考文献:

[6]邢琪昌,陈佳,李伟,等.基于网络药理学研究芍药苷治疗糖尿病周围神经病变作用机制[J].中国药理学与毒理学杂志,2019,33:725.

[14]孙连庆,王煊,李晓瑾,等.丹参酮ⅡA抑制波动性高糖诱导的雪旺细胞凋亡的观察[J].中国糖尿病杂志,2015,23:1027-1031.

文章来源：朱晏伯,李潇,朱笳悦,许利平,杨鑫伟.芍药苷对高糖环境下雪旺细胞线粒体动力学的影响[J].中国糖尿病杂志,2022,30(03):214-220.