金银花为忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花，具有清热解毒、疏散风热等功效，常用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温热发病等症[1]。挥发油是金银花的有效成分之一，其化学成分和种类较多，含有丰富的醇、醛、酯、酮、烷、烯等成分[2,3]，常用于医药、香料、食品等工业[4,5,6]。目前，金银花挥发油的提取方法主要有水蒸气蒸馏法[7]、超临界CO2萃取法[8]、超声辅助提取法[9]等。其中水蒸气蒸馏法提取时间长、温度高，易造成热不稳定及易氧化成分的破坏及挥发损失[10]；超临界CO2萃取法较难萃取相对分子质量高的物质且设备投资较大，成本较高[11]；超声辅助提取法超声波能量分布不均匀，应用主要集中在小型实验室阶段，工业规模的生产应用还很有限[12]；而本实验所用的固相微萃取法作为一种新颖的样品前处理技术，集采样、萃取、浓缩、进样于一体，具有待测物质用量少、无损伤等优点以及可与气相色谱-质谱联用，已在研究样品的挥发性成分中广泛应用，取得了很好的结果[13,14,15]。由于提取方法及品种的差异导致金银花挥发油成分相差较大，同时金银花在不同发育时期成分差异也很显著，因此有必要对金银花挥发性物质开展动态研究。以“华金6号”6个不同发育时期的金银花为原料，采用顶空固相微萃取-气质联用技术（HS-SPME-GC-MS）提取其挥发性物质，并对得到的挥发性物质的相对含量进行主成分分析（PCA）和聚类分析（HCA）。

研究表明金银花挥发性成分具有抗菌、抗病毒、解热、消炎、降胆固醇、调血脂、抑制癌症、预防和调节心血管疾病等药理和生理作用[16,17,18]。金银花挥发性成分的全面提取鉴定，对于完善金银花药材的质量标准以及药效作用具有重要意义。本研究旨在为后期金银花抗性育种及药理活性的研究提供一定的借鉴。

1、仪器与材料

1.1 材料

“华金6号”金银花于2021年5月采自山东中医药大学药用植物园，根据发育时期将其分为6类，从早到晚分别为米蕾期（RB）、三青期（TG）、二白期（TW）、大白期（BW）、银花期（HS）、金花期（GF），具体见表1。材料采摘后液氮速冻，-80℃保存备用。经山东中医药大学张永清教授鉴定为忍冬科植物忍冬L.japonicaThunb.的花蕾。氯化钠（分析纯，成都市科龙化工试剂厂），正己烷（色谱纯，德国Merck公司），C7～C40正构混标烷烃标准品（北京振翔科技有限公司）。

1.2 仪器

8890-5977B型GC-MS气质联用仪（美国Agilent公司），MS105DU型电子天平（瑞士MettlerToledo公司），MM400型球磨仪（德国Retsch公司）；120μmDVB/CAR/PDMS萃取头（美国Agilent公司），SPMEAllowCond型固相微萃取装置（瑞士CTCAnalyticsAG公司），FiberConditioningStation型老化装置（瑞士CTCAnalyticsAG公司）。

2、方法

2.1 HS-SPME条件

固相微萃取条件参考Wang等[19]方法进行，部分实验条件进行了优化。从-80℃冰箱中取出样品进行液氮研磨，涡旋混合均匀，每个样本称取约1g于顶空瓶中，分别加入饱和氯化钠溶液，10μL内标溶液。在100℃恒温条件下，震荡5min，使用120µmDVB/CAR/PDMS萃取头插入样品顶空瓶，顶空萃取15min，于250℃下解吸5min。采样前萃取头在FiberConditioningStation中加热老化5min，每个样品重复6次。

2.2 GC-MS条件

2.2.1 GC条件

石英毛细管色谱柱：AgilentHP-5MS(250μm×0.25μm,30m）；载气为高纯氦气（纯度不小于99.999%）；恒流体积流量1.0mL/min，进样口温度250℃，不分流进样，溶剂延迟3.5min。程序升温：40℃保持3.5min，以10℃/min升至100℃，再以7℃/min升至180℃，最后以25℃/min升至280℃，保持5min。

2.2.2 MS条件

离子源：电子轰击源（EI），离子源温度230℃，四级杆温度150℃，质谱接口温度280℃，电子能量70eV，扫描方式为全扫描模式（SCAN），质量扫描范围m/z50～500。

2.3 检索定性

将各色谱峰对应的质谱图与NIST05、NIST05s标准谱库比对，结合保留指数（retentionindex,RI）定性挥发性物质及其相对含量。

2.4 数据分析

采用R软件的内置统计prcomp函数对代谢物含量数据归一化并进行PCA；使用R软件pheatmeap包绘制热图，对不同样本的代谢物进行HCA。

3、结果与分析

3.1 不同生长时期金银花挥发性物质的比较

依照上述GC-MS条件对金银花挥发性成分进行分析，得出的总离子流图见图1。经质谱解析，金银花6个不同发育时期中共分离鉴定出260个挥发性成分，它们的峰面积之和占总峰面积的99%以上，可以反映金银花样品中挥发性成分的总体特征。通过HS-SPME-GC-MS与RI分析，共鉴定出260种挥发性物质，包含14种类型的挥发性物质：萜类（44种）、酮类（30种）、醇类（17种）、酯类（61种）、烃类（25种）、醛类（26种）、酸类（4种）、醚类（3种）、杂环类（31种）、卤代烃（3种）、腈类（3种）、酚类（4种）、胺类（4种）和其他类（5种）。

将鉴定出的260种挥发性物质进行分类及相对含量分析，结果表明（表2），醛类、酯类、杂环类、酮类、萜类是金银花挥发性物质中最主要的5类，占总含量的80%～90%。醛类中的己醛、(E)-2-己醛、苯乙醛和苯甲醛，酯类中的3-甲基丁烷-2-基(E)-2-甲基丁-2-烯酸酯、3,4-二甲基苯甲酸甲酯、十六酸甲酯和乙酸芳樟酯，杂环类的异喹啉和6-甲基-3(2H)-哒嗪酮，酮类的2,5-二羟基-4-异丙基-2,4,6-环庚三烯-1-酮和1-二氢茚酮，萜类的甲基异冰片和香叶醇在金银花中的相对含量较高。金银花样品中部分挥发性物质相对含量高、香气阈值低且具有独特的香型，对其香气有明显的贡献，如在天然具香植物中普遍存在的香叶醇，多具有花香或具玫瑰的自然香气[20]；乙酸芳樟酯有类似铃兰、薰衣草等香精油的幽雅香气[21]；α-荜澄茄油烯具有柑橘样香气[22]，己醛具有青味等。在检测出的260种物质中，有204种是6个金银花样品中的共有成分。其中，植物醇、亚油酸、木蜡酸甲酯、亚麻酸甲酯、十六酸甲酯、植酮、亚油酸甲酯、己醛、十四烷、(E)-2-庚烯醛等几十种物质均在已有研究中被检测出来且相对含量较高[2,3,8,9,23]，说明本研究检测到的挥发性成分具有较好的代表性。

醛类物质中，己醛随着金银花的生长呈先增加后减少的趋势，(E)-2-己醛呈减少趋势，苯甲醛呈增加趋势，苯乙醛呈先减少后增加趋势；酯类物质中，3-甲基丁烷-2-基(E)-2-甲基丁-2-烯酸酯和乙酸芳樟酯呈减少趋势，十六酸甲酯无规律可循；杂环类物质中，异喹啉和6-甲基-3(2H)-哒嗪酮呈先增加后减少趋势；酮类物质中，2,5-二羟基-4-异丙基-2,4,6-环庚三烯-1-酮呈先增加后减少趋势，1-二氢茚酮呈先减少后增加趋势；萜类物质中，甲基异冰片呈先增加后减少趋势，香叶醇呈先减少后增加趋势。综上，不同生长时期金银花间挥发性成分种类与总量变化无明显规律性。

3.2 金银花挥发性物质的PCA分析

PCA常用来研究如何通过少数几个主成分来揭示多个变量的内部结构，即从原始变量中通过少数几个主成分来揭示多个变量的内部结构，即从原始变量中导出少数几个主成分，使其尽可能多地保留原始变量的信息，且彼此间互不相关，通常数学上的处理就是将原来多个指标作线性集合，作为新的综合指标[24]。通过R软件对6个金银花样品260个挥发性物质的相对含量进行PCA。分析得到各主成分的特征值、方差贡献率、累积方差贡献率见表3。由表3可知，特征值大于1的共15个主成分，总方差86.65%的贡献率来自前5个主成分，其方差贡献率依次为52.14%、21.84%、5.89%、4.08%和2.70%，说明这5个主成分反映了金银花样品的绝大部分信息。因此6个金银花样品检测出的260种物质降到5个不相关的主成分，成功达到了降维目的。

由表3可知，第1、2、3主成分分别解释了总变异的52.14%、21.84%、5.89%。以PC1、PC2和PC3为三维坐标轴，绘制其因子负荷散点图，得到260种金银花挥发性物质的三维因子载荷散点图（图2）。图2反映了不同的挥发性物质对主成分的影响，PC1中载荷较高的正影响挥发性物质主要有α-卡迪诺、十八醛、2-十五烷酮、反式2,4-二甲基噻吩，S,S-二氧化物、N-苄基甘氨酸乙酯；载荷较高的负影响挥发性物质有2-辛烯醛、2,4-戊二炔基-苯、1,3-二氢-1-甲基-2H-苯并咪唑-2-酮。PC1的差异主要集中在杂环类物质。PC2中载荷较高的正影响挥发性物质主要有(5R,8aR)-5-氢丙啶、磷氰基硫代二氟化物、N,N,S-三甲基-4-氨基苯硫酚、3-乙基-1H-1,2,4-三唑、2-乙基-1,3,2-二氧杂硼环烷-4-酮；载荷较高的负影响挥发性物质主要有香叶醇、1-二氢茚酮、香叶酸、3,4-二甲基苯甲酸甲酯、1-(3-乙氧基苯基)丙酮。PC2的主要差异集中在萜类和酮类物质。PC3中载荷较高的正影响挥发性物质主要有奈洛利多1、2-丁基-2-辛醇、(R*,R*)-4-甲基-α-(1-甲基-2-丙烯基)-苯甲醇、4-(1-甲基)苯酚、4-甲基苯甲酸环己酯；载荷较高的负影响挥发性物质主要有正壬醛、十五烷、甲酸2-甲氧基苯酯、3,5-二甲氧基甲苯、2-己基-1-癸醇。PC3的差异主要集中在醇类物质。

由图3可知，6个不同生长时期的金银花品种来看，PC1得分最高的是GF,PC2得分最高的是BW,PC3得分最高的是TW。6个金银花样品可区分为4类，其中RB和TG归为1个集群；TW单独归为1个集群，BW和HS归为1个集群；GF单独归为1个集群同一个集群的金银花样品所含物质相似，含有相似物质的金银花可以考虑混合采集应用到后续的生产与加工中。

3.3 金银花挥发性物质的聚类分析

代谢物含量数据采用unitvariancescaling(UV）归一化处理，通过R软件pheatmap包绘制热图，对代谢物在不同样本间的积累模式进行HCA，结果见图4。

结果表明，6个金银花样品可区分为4类，其中RB和TG归为1个集群；TW单独归为1个集群，BW和HS归为1个集群；GF单独归为1个集群。主成分分析结果和积累分析结果一致，说明通过两者的分析，均可对6个金银花样品进行分类。

4、讨论

本研究采用HS-SPME-GC-MS法对6个不同发育时期金银花的挥发性物质进行定性定量分析，供试的6个金银花花样品共鉴定出260种挥发性物质，其中包括萜类、酮类、醇类、酯类、烃类、醛类、酸类、醚类、杂环类化合物、卤代烃、腈类、酚类、胺类和其他类14种类型的挥发性物质。应用GC-MS技术，多人对金银花挥发油进行过分析研究，如王玲娜等[9]用超声辅助石油醚提取法从“华金6号”金银花中鉴定出34个化合物，其主要成分为有机烃、酸、酯、酮类等化合物，含量较高的为2-十七烷酮（19.15%）、邻苯二甲酸二丁酯（10.54%）、2-十九烷酮（8.70%）、2,4-双-(1,1-二甲乙基)-苯酚（5.55%），没有鉴定出萜类、醛类等成分；管仁伟等[7]用水蒸气蒸馏法从“九丰一号”金银花中鉴定出49个化合物，其中以烯醇类、酯类、烷烃类为主，含量较高的为棕榈酸甲酯（13.99%）、抗坏血酸二棕榈酸酯（7.22%）、亚麻酸甲酯（9.20%）、正二十九烷（8.77%）。前人对金银花挥发油的提取鉴定无论是从种类还是数量上都相对较少，这可能与金银花品种或提取工艺有关。近年来，HS-SPME-GC-MS法广泛应用于中药挥发油提取，但在金银花中应用甚少，因此该实验采用HS-SPME-GC-MS法获得了相对多的挥发油种类及数量，为金银花的挥发性成分的研究和开发利用提供重要的依据。

根据报道，本实验鉴定出金银花的260种挥发性成分中，部分成分与蚜虫的趋化作用有关，如1-己醇、己醛、反式-2-己醛、水杨酸甲酯、甲基异己烯基酮、苯甲醛、正辛醛、正壬醛等物质对蚜虫均有不同程度的吸引作用[25,26,27,28];2,6-壬二烯醛、L-α-松油醇、香叶基丙酮等物质对蚜虫均具有不同程度的趋避作用[29,30]，下一步可采取有针对性的措施来培育抗蚜的金银花品种。

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文章来源：蒲俊杰,刘谦,李佳,刘振华,张永清,贺吉香,蒲高斌.金银花不同发育时期挥发性成分的HS-SPME-GC-MS分析[J].中草药,2022,53(09):2818-2824.