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黄精对原发性痛经大鼠药效作用初步研究

2022-05-23 222 上传者：管理员

摘要：目的建立原发性痛经大鼠模型，初步研究黄精对原发性痛经大鼠的药效作用。方法采用大鼠雌激素与缩宫素联合法建立原发性痛经大鼠模型。通过观察大鼠的扭体反应，判断原发性痛经大鼠模型是否建立成功；ELISA法检测大鼠血清中6-keto-PGF1α和β-EP的含量以及子宫组织中PGF2α和PGE2的含量；离体组织器官恒温灌流系统测定子宫肌张力。结果　与正常组相比，模型组大鼠扭体潜伏时间缩短，扭体次数明显增加，表明原发性痛经大鼠模型建立成功。与模型组相比，各治疗组大鼠血清中6-keto-PGF1α、β-EP的含量显著提升，大鼠子宫组织中PGF2α的含量明显降低，PGE2的含量显著提升，子宫肌张力明显下降。HE染色结果表明，治疗组大鼠子宫上皮细胞空泡病变基本消失，充血现象明显改善。结论黄精对原发性痛经大鼠具有良好的治疗效果，其可能与大鼠体内PGE2、PGF2α等因子有关。

关键词：
中药治疗
原发性痛经
扭体反应
药效学
黄精
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痛经发生在月经前后期或月经期间，痛经发生时小腹有疼痛、坠胀感，同时还伴有腰酸或其他疼痛。在临床上，主要将痛经分为两种，一种是原发性痛经，另外一种是继发性痛经，在这两者中原发性痛经占90%以上。对广大女性朋友来说，痛经不仅仅伤害了她们的身心健康，还给她们的工作及学习带来了严重的困扰，因而预防和治疗原发性痛经已经成为医学界迫切需要解决的问题。大多数研究者认为原发性痛经的产生与前列腺素E2(PGE2)、前列腺素F2α(PGF2α)、β-内啡肽(β-EP)、6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)及其他因素有关[1,2,3,4,5,6,7]。PGF2α含量升高可引起子宫平滑肌过强收缩，血管痉挛，造成子宫缺血、乏氧而出现痛经；PGE2则能抑制子宫平滑肌的自发活动，降低PGF2α/PGE2比值可在一定程度上缓解疼痛。β-EP水平降低可使子宫功能失常，成为疼痛的原因之一。前列腺环素(PGI2)有扩张血管和抑制血小板聚集的作用，而6-keto-PGF1α作为PGI2的代谢产物，性质稳定，可以反映PGI2的含量。因此，本文选择上述代表性生化指标、组织病理指标以及子宫肌张力对黄精药效学进行初步评价。

黄精是我国常用传统中药之一，用药历史悠久，同时也是一种药食同源的中药材。具有补肝益肾、延年益寿等功效，被尊崇为养生之圣药。黄精的记载始于梁朝陶弘景《名医别录》，并列于草部的首位。研究表明其具有抗炎[8,9,10]、镇痛[11]、抗肿瘤[12,13]、调节血糖血脂[14,15,16,17,18,19]和抗衰老[20]等药理作用。《本经逢原》：“黄精，宽中益气，使五藏调和，肌肉充盛，骨髓强坚，皆是补阴之功。”一种具有益肾调经功能的组合物及其应用的专利表明，该组合物可以用于治疗因肾气虚弱、血亏血滞导致的卵巢功能早衰、月经不调以及原发性痛经，其中黄精的补气养阴、健脾润肺益肾作用起到了很大的作用[21,22,23,24,25]。

基于黄精的“补阴之功”，从原发性痛经的发病机制出发，为了能更好的挖掘黄精的药用范围，本文通过建立原发性痛经大鼠模型，初步探究黄精对原发性痛经的治疗作用。

1、材料

1.1 试药

黄精(采自安徽省池州市青阳县酉华镇，经安徽中医药大学药学院俞年军教授鉴定为百合科黄精属植物多花黄精PolygonatumcyrtonemaHua.的干燥根茎)；戊酸雌二醇片(拜耳医药保健有限公司广州分公司，批号：492A)；缩宫素注射液(宁波第二激素厂，批号：201212)；妇科千金片(株洲千金药业股份有限公司，批号：20191011)；乐氏液(上海源叶生物科技有限公司，批号：R20265)；大鼠PGF2α酶联免疫试剂盒(批号：JL13273)、大鼠PGE2酶联免疫试剂盒(批号：JL12636)、大鼠6-keto-PGF1α酶联免疫试剂盒(批号：JL11068)、大鼠β-EP酶联免疫试剂盒(批号：JL20852)(上海江莱实业股份有限公司)。

1.2 实验动物

健康SD大鼠，雌性，体质量(220±20)g，购于安徽医科大学动物实验中心[许可证号SCXK(皖)2017-001；本实验使用所有动物均通过安徽中医药大学动物伦理委员会批准，动物伦理编号：AHUCM-rats-2021024]。将购买的大鼠在实验室动物房适应性饲养一周。饲养期间，正常喂饲料、喂水，房间温度为25℃，房间湿度为60%～65%。

1.3 仪器

恒温平滑肌实验系统(成都泰盟软件有限公司，HW200S)；BL-420N信号采集与分析系统、FT-102生物张力传感器(成都泰盟软件有限公司)；离心机(德国Eppendorf公司，Centrifuge5417R)；多功能酶标仪(美国MD公司)；微量移液器(德国Eppendorf)；艾科浦超纯水系统(中国重庆颐洋企业发展有限公司，AD3L)；电子天平(上海菁海仪器有限公司，FA2004N)；BHWY-100BC恒温振荡培养箱(常州杰博森仪器有限公司)。

2、方法与结果

2.1 黄精水提液的制备

根据《中国药典》(2020年版)黄精临床指导用药用量9～15g[26]，参考陈奇主编的《中药药理研究方法学》，查表可得人和大鼠间体表面积的折算系数为6.3[27]。按临床指导每年平均用药量9g、12g、15g换算成大鼠的用药量，即大鼠用药低、中、高剂量分别为0.945、1.26、1.575g·kg-1。取适量黄精，加入10倍总生药量的水，加热提取两次，每次2h，合并浓缩水提物至0.945、1.26、1.575g·kg-1，灭菌备用。

2.2 模型复制

实验采用雌激素与缩宫素联合使用的方法制备大鼠原发性痛经模型，除了正常组以外，其余各组的每只大鼠均每日1次灌胃给予戊酸雌二醇片，使各组大鼠子宫处于共情期，提高大鼠子宫的敏感程度。给药周期为10d，其中第1日和第10日每只大鼠给药0.2mg，第2日至第9日每只大鼠给药0.1mg，末次给药1h后，各组大鼠腹腔注射缩宫素2U/只[21]，观察30min内大鼠的疼痛反应。将扭体反应作为子宫强烈收缩即痛经的指标，同时扭体反应也可以直观地反映原发性痛经模型建立成功。

2.3 分组与给药

采用体质量随机区组的方法将大鼠分为正常组，阳性对照组(妇科千金片)，模型组，黄精水提物低、中、高剂量组，每组10只。从给予戊酸雌二醇片第5日开始，按照各组给药剂量灌胃给药，其中阳性对照组给药剂量为0.08g·kg-1，黄精水提物低、中、高剂量组分别给予0.945、1.26、1.575g·kg-1黄精水提物，正常组和模型组均灌胃给予等量大豆油，连续7d。

2.4 行为学测试

扭体表现为大鼠腹部向内凹陷、躯干和后肢伸展、臀部和一侧的肢体内旋[21,22,23]，有时还有抱头舔腹的行为。最后一次灌胃给予戊酸雌二醇片1h后，观察注射完缩宫素后10～30min内大鼠的扭体反应情况，记录扭体潜伏时间和扭体次数。结果与正常组相比，模型组大鼠扭体潜伏时间显著缩短(P<0.05)，扭体次数显著增加(P<0.05)。与模型组相比，黄精低、高剂量组及阳性对照组均可延长扭体潜伏时间，降低扭体次数(P<0.05)(见图1)。

2.5 大鼠血清中6-keto-PGF1α和β-EP含量以及大鼠子宫组织中PGF2α和PGE2含量的测定

末次给药后，对各组大鼠进行腹腔注射2%戊巴比妥钠(2mL·kg-1)麻醉，将大鼠仰卧置于解剖台上，进行腹主动脉取血，全血室温静置10～20min至血液凝固后离心，3000r·min-1离心15min后留取血清。严格按照ELISA试剂盒说明书，测定大鼠血清中6-keto-PGF1α和β-EP的含量。

取大鼠子宫组织，按1∶9比例加入磷酸盐缓冲液(PBS)，匀浆后离心，取上清液，严格按照ELISA试剂盒说明书，测定大鼠子宫组织中PGF2α和PGE2的含量。

与正常组相比，模型组大鼠血清中6-keto-PGF1α和β-EP水平均显著降低(P<0.05)。与模型组相比，黄精高剂量组、中剂量组、低剂量组均可显著提升大鼠血清中6-keto-PGF1α和β-EP的含量(P<0.05，P<0.01)。结果见图2A、2B。

与正常组相比，模型组大鼠子宫组织中PGF2α水平显著升高(P<0.05)，PGE2含量显著降低(P<0.05)。与模型组相比，黄精中剂量组可降低大鼠子宫组织中PGF2α的含量，提升PGE2的含量(P<0.001)，从而使PGF2α/PGE2的比值降低，缓解痛经。结果见图2C、2D。

2.6 组织病理学检测

分离子宫组织，浸泡于4%多聚甲醛缓冲液中，固定。石蜡包埋后，进行常规的HE染色，观察子宫病理变化情况。

由图3可见，正常组大鼠子宫组织形态正常，组织平滑形态清晰，而模型组大鼠子宫组织内膜变薄，上皮细胞空泡样变，子宫肌层有充血现象。阳性对照组大鼠子宫内膜细胞少量空泡样病变。黄精高剂量组大鼠子宫上皮细胞空泡病变基本消失，充血现象明显改善。黄精中剂量组大鼠子宫内膜相对平整，空泡样病变基本消失。黄精低剂量组大鼠子宫上皮细胞空泡变化有所改善。

2.7 缩宫素致大鼠离体子宫平滑肌收缩程度的测定

将大鼠麻醉后解剖，完全暴露子宫，快速剪取一侧子宫，立即放置在盛有乐氏液的玻璃平皿中充分清洗干净，仔细清除子宫上残留的结缔组织和脂肪，用乐氏液冲洗子宫，将子宫内容物充分洗净，在整个过程中注意不要过分拉伸子宫。然后剪取中间段子宫平滑肌约2cm，注意必须现取现用，避免时间过长子宫平滑肌失去活性。平滑肌两端分别系上缝合线，将HW200S恒温平滑肌实验系统的温度调整至37℃，管内加入足量乐氏液，将系上缝合线的子宫平滑肌置于该系统内，使阴道端固定于小钩上并固定在管内，另一端连接在张力传感器上。实验过程中持续向乐氏液内通入氧气，速度为每1～2s一个气泡，使子宫平滑肌正常自主收缩。通过BL-420N信号采集与分析系统记录大鼠离体子宫平滑肌的收缩曲线，先稳定半小时至子宫收缩稳定后，先记录一段子宫正常收缩曲线6min，然后向管内加入缩宫素50μL，记录曲线1min，随后依次向管中加入各种药液，分别记录曲线6min。最后对曲线进行分析，得出张力值和频率，并计算活动度(活动度=平均张力值×频率)。

与模型组大鼠相比，黄精组与阳性对照组的子宫组织张力，收缩频率及活动度均有明显变化；黄精高剂量组和阳性对照组大鼠的子宫组织平滑肌平均张力具有统计学差异(P<0.05，P<0.01)。黄精高剂量组、黄精中剂量组和阳性对照组大鼠的子宫组织收缩频率均有统计学差异(P<0.05，P<0.01)。黄精中、高剂量组和阳性对照组大鼠的子宫组织平滑肌活动度也具有统计学差异(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。其中黄精高剂量组较黄精组其他两组效果较优。结果见表1。

2.8 统计学处理

实验所有检查结果经SPSS25.0软件进行数据统计分析，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD分析，方差不齐时用Dunnett’s方法分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

3、讨论

痛经是妇科临床的常见病，症状严重的患者甚至会昏厥，给广大女性带来诸多困扰。研究原发性痛经，需要选择合适的动物模型，目前公认的关于原发性痛经动物模型是用雌激素与缩宫素联合使用建立[14]。因此，本研究采取这种方法复制原发性痛经动物模型，研究黄精对原发性痛经的药效作用。

原发性痛经发病机制复杂，然而大多数研究者认为原发性痛经的产生与前列腺素、缩宫素、前列环素及其他一些因素有关。其中PGE2和PGF2α发挥主要作用。研究表明痛经患者的子宫内膜和经血中PGF2α浓度会远远高于正常女性，痛经越严重，患者体内的PGF2α/PGE2的比值越高[2]。本实验结果表明，黄精能够降低原发性痛经大鼠子宫组织中PGF2α的含量，提升PGE2的含量，降低PGF2α/PGE2的比值，抑制子宫收缩。

研究发现，当子宫中β-内啡肽含量上升时，其内源性镇痛作用会使子宫疼痛减轻，子宫慢慢恢复正常，而当子宫中β-内啡肽含量过低时，会导致子宫收缩异常，进而导致痛经的产生[24]。除此之外，PGI2含量降低则会造成子宫收缩异常、肌张力增高、收缩频率增加，从而导致子宫血流量降低，子宫缺血，痉挛等从而引发痛经。6-keto-PGF1α是PGI2的代谢产物，其性质稳定，所以可以测量其代谢产物6-keto-PGF1α的含量，以此间接反应PGI2的水平[7]。实验结果显示，黄精可显著提升大鼠血清中β-EP和6-keto-PGF1α的含量。

以上实验结果提示，痛经大鼠子宫过度收缩，造成子宫组织损伤，导致炎症反应的发生。黄精组大鼠子宫内壁空泡变化有所改善、充血现象明显改善、子宫内膜相对光滑平整。同时，黄精组能显著降低痛经大鼠子宫收缩频率和收缩张力，达到缓解痛经的效果。

综上，本实验首次在黄精原有的药理作用上，以黄精的抗炎、镇痛、补阴益肾作用为基础，进而探究黄精对原发性痛经大鼠模型的药效作用。本研究结果提示黄精可能对原发性痛经具有药效作用，为黄精的临床应用提供了实验依据。

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