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经典名方二冬汤基准样品HPLC指纹图谱研究

2023-07-29 97 上传者：管理员

摘要：建立经典名方二冬汤基准样品的HPLC指纹图谱分析方法，为二冬汤基准样品的质量控制提供理论依据。方法:采用Inertsil ODS-4(4.6 mm×250 mm, 5μm)色谱柱，以0.05 mol/L的醋酸铵-冰醋酸溶液(取3.85 g醋酸铵溶于1000 mL水中，加入30 mL乙酸)为流动相A,乙腈为流动相B,梯度洗脱(0～52 min, 14%～21%B;52～75 min, 21%～44%B;75～90 min, 44%～67%B),流速0.8 mL/min,检测波长254 nm,进样量10μL,使用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012版),对15批二冬汤基准样品相似度进行分析，对共有色谱峰进行指认及药味归属。结果:建立了二冬汤基准样品HPLC指纹图谱，15批样品相似度均>0.90,共标定9个共有峰，经对照品比对，指认出7个成分，分别为芒果苷、金丝桃苷、黄芩苷、千层纸素A-7-O-β-D葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、甘草酸、黄芩素。结论:该研究建立的指纹图谱方法稳定可行，可初步整体性评价二冬汤基准样品的质量，为后期复方制剂的研究提供参考。

关键词：
二冬汤
基准样品
指纹图谱
提高机体免疫力
相似度评价
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二冬汤出自于清·程国彭的《医学心悟》,由天冬二钱(去心),麦冬三钱(去心),花粉一钱，黄芩一钱，知母一钱，甘草五分，人参五分，荷叶一钱组成。用于烦渴不止，小便频数，脉数无力等症[1]。现代药理研究表明，二冬汤具有降糖[2,3]、抗癌[4]、抗炎[5]、提高机体免疫力[6]等作用。二冬汤在临床上应用广泛，治疗糖尿病具有较好的临床疗效[7],对青年人特发性室性期前收缩有效[8,9],对甲状腺功能亢进也有临床疗效[10,11],开发价值较大。指纹图谱能够较全面地反映样品整体化学组分的信息特征，常用于评价复方中药的质量。本研究建立的HPLC指纹图谱分析方法可作为经典名方二冬汤基准样品质量的整体性评价方法，以期为该方复方制剂的研究提供参考。

1、仪器与试药

1.1仪器

高效液相色谱仪(型号：Agilent 1260Ⅱ,安捷伦科技公司);高效液相色谱仪(型号：LC-20A,日本岛津公司);十万分之一电子天平(型号：MS105Du/A,德国Meteler公司);万分之一电子天平(型号：ATX224型，日本岛津公司);电子天平(型号：LT3002E型，常熟市天量仪器有限责任公司);冷冻干燥机(型号：LGJ-10型，北京松原华兴科技有限公司);数控超声波清洗器(型号：KQ-500DE型，昆山市超声仪器有限公司);电热恒温水浴锅(型号：DK-98-ⅡA型，天津市泰斯特仪器有限公司);电热鼓风干燥箱(型号：101-2AB型，天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.2试剂及试药

黄芩苷(批号：110715-201821,纯度：95.4%)、汉黄芩苷(批号：112002-201702,纯度：98.5%)、黄芩素(批号：111595-201607,纯度：98.5%)、甘草酸铵(批号：110731-201720,纯度：97.7%)、芒果苷(批号：111607-201704,纯度：98.1%)、金丝桃苷(批号：110521-201809,纯度：94.9%)均购自中国食品药品检定研究院，千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(批号：170803,纯度：≥98%)购自成都普菲德生物技术有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯，水为娃哈哈水，其他试剂为分析纯。

二冬汤处方各药材均采自道地产地和主产区，经贵州中医药大学魏升华教授鉴定为正品，均符合《中国药典》2020年版一部有关规定。15批(批号：WMJZ01～WMJZ15)二冬汤基准样品(经提取、浓缩、冻干制备而成)由贵州威门药业股份有限公司提供。

2、方法与结果

2.1色谱条件

采用Inertsil ODS-4(4.6 mm×250 mm, 5μm)色谱柱，以0.05 mol/L的醋酸铵-冰醋酸溶液(取3.85 g醋酸铵溶于1000 mL水中，加入30 mL乙酸)为流动相A,乙腈为流动相B,梯度洗脱(0～52 min, 14%～21%B;52～75 min, 21%～44%B;75～90 min, 44%～67%B),流速0.8 mL/min,检测波长254 nm,进样量10μL。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于2500。

2.2溶液制备

2.2.1供试品溶液制备

取基准样品约1 g,精密称定，精密加入70%乙醇50 mL,称定重量，超声处理(功率500 W,频率40 kHz)30 min,放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.2各单味药供试品溶液制备

分别精密称取黄芩、知母、荷叶、天冬、麦冬、人参、天花粉各0.3 g,甘草0.2 g,置具塞锥形瓶中，分别加水50 mL,煎煮30 min,滤过，蒸干，残渣加70%乙醇溶解并转移至50 mL量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3对照品溶液制备

精密称取芒果苷、金丝桃苷、黄芩苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵对照品适量，加甲醇分别制成30.59μg/mL、0.208 8 mg/mL、0.202 1 mg/mL、0.196 0 mg/mL、88.00μg/mL、0.226 6 mg/mL、25.57μg/mL的溶液，即得。

2.2.4参照物溶液制备

取黄芩苷对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含0.4 mg的溶液，即得。

2.3方法学考察

2.3.1专属性试验

分别取“2.2.1”项下供试品溶液(WMJZ01号样品)、“2.2.4”项下参照物溶液和空白溶剂(70%乙醇),根据“2.1”项下色谱条件检测，并延长30 min。结果，空白溶剂对图谱测定无干扰，供试品在与参照物黄芩苷峰对应位置有相同的色谱峰，且主要成分在图谱中均有体现，本方法专属性和完整性良好。见图1。

图1二冬汤基准样品指纹图谱专属性考察色谱图

注：A-空白溶剂(70%乙醇);B-黄芩苷对照品溶液；C-二冬汤基准样品供试品溶液。

2.3.2精密度试验

取WMJZ01号样品，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件连续进样6次进行测定，记录色谱图，以4号色谱峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间RSD均≤0.34%,峰面积RSD均≤2.54%,见表1,说明该仪器精密度良好。

2.3.3稳定性试验

取WMJZ01号样品，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、8、16、24、36、48 h进样，以4号色谱峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间RSD均≤0.47%,峰面积RSD均≤3.93%,见表1,说明样品的供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.3.4重复性试验

取WMJZ01号样品6份，分别按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件测定，以4号色谱峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间RSD均≤0.29%,峰面积RSD均≤1.93%,见表1,说明该方法重复性良好。

表1经典名方二冬汤基准样品指纹图谱方法学考察结果(相对标准偏差)导

2.3.5耐用性试验

取WMJZ01号样品，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件测定，以4号色谱峰为参照峰，开展了流动相的不同流速(0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min)的考察，结果在流速为1.2 mL/min时，9号峰前移，故该方法需固定流速为0.8 mL/min;开展了不同柱温(25℃、30℃、35℃)的考察，结果在不同柱温条件下的色谱图中各共有峰峰型尖锐，对称，分离度良好，表明该方法不同柱温条件下耐用性良好；开展了不同色谱柱(Inertsil ODS-4、华普Tnature C18、Inertsil ODS-3)的考察，结果在不同色谱柱中以Inertsil ODS-4分离效果最佳，其余色谱柱分离效果不佳且信息量减少，并对Inertsil ODS-4型色谱柱不同S/N号(8EF37062、7CF37036、20E0114691)进行测定，结果各共有峰峰型尖锐，对称，分离度良好，故该方法需固定色谱柱为Inertsil ODS-4(4.6 mm×250 mm, 5μm)。

2.4指纹图谱的建立及相似度评价

取WMJZ01～WMJZ15号样品，分别按“2.2.1”项下方法制备15批次供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件测定，记录15批二冬汤基准样品色谱图，导入“中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统(2012版)”进行数据匹配，见图2。15批基准样品中共标定9个共有峰，经对照品比对，指认出7个成分，分别为芒果苷、金丝桃苷、黄芩苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、甘草酸、黄芩素，见图2。其余2个峰(峰2和峰5)还需进一步研究。相似度评价结果显示，15批样品指纹图谱的相似度值0.996～1.000,平均值为0.998,均大于0.90。说明各批次间差异小，化学成分相似，表明15批二冬汤基准样品质量相对稳定，可选择指纹图谱作为二冬汤基准样品的评价标准。

图2 15批二冬汤基准样品HPLC指纹图谱叠加图(A)和对照指纹图谱(B)

2.5共有色谱峰的归属

取“2.2.2”项下方法制备的各单味药材溶液，分别根据“2.1”项下色谱条件进样测定，将所得色谱图进行叠加，见图3。结果将各共有峰追溯到各单味药，其中峰1来自知母，峰2、3来自荷叶，峰4～7、9来自黄芩，峰8来自甘草，但未发现天冬、麦冬、天花粉、人参的色谱峰。

图3药味归属HPLC对比图谱

注：从上到下，分别为：黄芩饮片溶液，荷叶饮片溶液，天冬饮片溶液，天花粉饮片溶液，人参饮片溶液，麦冬饮片溶液，知母饮片溶液，甘草饮片溶液，二冬汤基准样品的供试品溶液，黄芩苷对照品溶液。

3、讨论

经典名方二冬汤为8味药组成，其基准样品经提取、浓缩、冻干制备而成，成分复杂。本研究考察了样品溶液制备方法，采用70%乙醇、稀乙醇、70%甲醇为提取溶媒时，色谱中峰信息量、响应值均相差不大，其中采用70%乙醇为提取溶剂时，基线平稳程度较好，故该样品制备方法采用70%乙醇作为提取溶媒。

本研究采用二极管阵列检测器，供试品溶液在190 nm～400 nm波长下进行扫描，通过等吸收图谱进行分析，结果显示色谱峰在250 nm～300 nm波长范围内，信息量较大。选取波长240 nm、250 nm、254 nm、260 nm、280 nm、300 nm、320 nm进行分析，在254 nm波长下，且各色谱峰响应值也较为适中，峰信息量较大，基线较平稳，故选择254 nm为检测波长。

本研究利用HPLC指纹图谱分析技术，对全方质量进行整体描述和评价，建立的指纹图谱分析方法共标定9个共有峰，与对照品对比，可指认7个成分，分别为芒果苷、金丝桃苷、黄芩苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、甘草酸、黄芩素；对各成分进行药味归属，来源于知母有1个成分、荷叶有2个成分、黄芩有5个成分，甘草有1成分。15批基准样品HPLC指纹图谱的相似度计算结果显示，相似度均大于0.90,且相似度差距较小，可用于二冬汤基准样品的质量综合评价，为该经方的复方制剂研究提供参考，同时也为该经方作用机制研究提供理论基础。但本研究建立的指纹图谱分析方法亦有一定的局限性：未发现君药天冬与麦冬、臣药天花粉、佐药人参的指标成分，帅丽霞等[12]建立的二冬汤指纹图谱也未发现这4味药的指标成分，其中天冬主要含皂苷类、多糖类、氨基酸类等成分[13]、麦冬主要含甾体皂苷、糖类、挥发油等成分[14],天花粉主要含蛋白质、多糖、皂苷等成分[15],人参主要含多糖、皂苷、挥发油等成分[16],以上这些成分紫外吸收均较弱，后期将结合蒸发光散射检测器对二冬汤基准样品中指标成分进一步研究，以期能够找到来源于这4味药的指标成分，并找到全方的药效物质基础。

参考文献:

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