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正交-满意度函数优化秦艽黄酮和环烯醚萜苷超声共提取条件

2023-11-17 115 上传者：管理员

摘要：目的：优化秦艽黄酮和环烯醚萜苷超声提取工艺条件。方法：以秦艽黄酮和环烯醚萜苷提取率为考察指标，以乙醇体积分数、料液比、提取温度及提取时间为影响因素，进行单因素试验；采用正交-满意度优化秦艽黄酮和环烯醚萜苷提取工艺。结果：优选出秦艽中黄酮及环烯醚萜苷提取的最佳工艺条件为乙醇体积分数60%，料液比1∶30 g/mL，提取温度60℃，提取时间40 min，在此条件下的提取率黄酮为2.20%，环烯醚萜苷为9.32%，平均满意度为0.997,RSD=0.28%。结论：优选的条件方法简便、高效、易于实现，适合秦艽中黄酮与环烯醚萜苷的提取。

关键词：
提取工艺
正交-满意度
环烯醚萜苷
秦艽
黄酮
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秦艽始载于《神农本草经》，为龙胆科植物秦艽（Gentiana macrophylla Pall.）、麻花秦艽（Gentiana straminea Maxim.）、粗茎秦艽（Gentiana crassicaulis Duthie ex Burk.）或小秦艽（Gentiana dahurica Fisch.）的根，为陕西道地药材，其味辛、苦，性平，具有祛风湿、止痹痛、清湿热、退虚热的功效[1]。环烯醚萜苷类和黄酮类化合物是秦艽标志性化学成分，现代药理研究表明，秦艽抗炎镇痛[2]、保肝[3]、抗病毒[4]、抗肿瘤[5]等作用的发挥均与以上两类成分有关。

目前，黄酮类化合物提取方法主要包括热水提取法[6]、有机溶剂提取法[7]、碱溶酸沉法[8]、微波提取法[9,10,11,12]、超声提取法[13,14]等，环烯醚萜苷类化合物提取方法主要包括溶剂提取法[15,16]、微波提取法[17]、超声提取法[18]等，超声提取法因其提取效率高、简单快速、成本低等优点，在中药材有效成分提取方法中占重要地位。本研究首次采用超声提取秦艽中黄酮和环烯醚萜苷类物质，并探讨其共提取最佳工艺条件，为秦艽药材利用最大化提供依据。

1、材料

1.1 试剂与药材

秦艽（采摘于陕西省太白县，经生药教研室雷国莲教授鉴定为龙胆科植物秦艽的根），芦丁对照品（20170221）购于上海源叶生物科技有限公司，龙胆苦苷对照品（PY20150908AT）购于南京普怡生物科技有限公司。亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇均为分析纯。

1.2 实验仪器与设备

AUY220电子天平（上海越平科学仪器有限公司）；TU-1810紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；KW600DB数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

2、方法与结果

2.1 秦艽黄酮及环烯醚萜苷提取

精密称取秦艽粉末1.0 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，以一定料液比加入50%乙醇溶液。在一定温度、功率下超声处理一定时间，取出后，放冷至室温，称重，加50%乙醇溶液，补足减失重量，过滤，收集续滤液。

2.2 单因素试验

根据预试验结果，设置乙醇体积分数（20%、40%、60%、80%、100%）、提取时间（20、25、30、35、40、45 min）、液料比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL）和提取温度（30、40、50、60、70℃）4个单因素，固定超声功率100W、提取时间20 min、料液比1∶15及提取温度30℃，分别考察以上因素对秦艽黄酮及环烯醚萜苷提取率的影响，确定各因素影响和适宜参数范围。

2.3 正交-满意度优化设计

依据单因素试验数据，分析选取乙醇体积分数（A）、料液比（B）、提取温度（C）、提取时间（D)4个因素。采用4因素3水平分析，以黄酮和环烯醚萜苷提取率为响应值，优选最佳提取工艺，正交试验因素与水平编码设计见表1。

表1 因素水平

以秦艽黄酮和环烯醚萜苷的提取率为目标响应值，通过对多个单因素的优化获得总体最优者。利用满意度函数将每个响应值按公式（1）转换为无量纲期望值di(0≤di≤1),d=0时说明满意度不符合预期值；d=1时说明满意度达预期值；总体满意度值取多个响应值的几何平均值，即符合公式（2）。

公式（1）中，Yi(x）指第i个指标的响应值，Ymin,i指实验数据中第i个指标的最低响应值，Ymax,i指实验数据中第i个指标的最高响应值；公式（2）中，Wi指第i个因子的权重，Wi满足0<Wi<1,且，设秦艽总黄酮的提取率为Y1，总环烯醚萜苷的最大提取率为Y2；设定总黄酮最大提取率为2.57%，最小提取率为0，设定总环烯醚萜苷的最大提取率为9.51%，最小提取率为0。总黄酮和总环烯醚萜苷的权重均为0.5，即W1=0.5和W2=0.5。把响应值Y1和Y2转变为总体满意度值，利用正交设计助手软件进行方差分析，通过响应值选出最大满意度值所对应的反应条件即为共提取最佳条件。

2.4 工作曲线绘制

2.4.1 芦丁标准曲线

精密称取芦丁对照品5.19 mg，置于50 mL容量瓶中，加50%乙醇溶解并定容至刻度，即制得浓度为0.104 mg/mL的芦丁对照品溶液。精密移取芦丁对照品溶液1、3、5、7、9 mL，分别置于25 mL容量瓶中，依次编号为1、2、3、4、5，加入50%乙醇3 mL，加入5%亚硝酸钠0.6 mL，摇匀静置6 min，加入10%硝酸铝0.6 mL，摇匀静置6 min，加入1 mol/L氢氧化钠4 mL，摇匀，加蒸馏水溶解并定容至刻度。以不加芦丁的试剂溶液为空白，用紫外-可见分光光度计在504 nm处测定吸光度值（A），以浓度（C）作为标准曲线横坐标（x），吸光度（A）为标准曲线纵坐标（y），绘制标准曲线并得到线性回归方程y=0.0182x+0.0055，相关系数R 2=0.99909。见图1。

图1 芦丁标准曲线

2.4.2 龙胆苦苷标准曲线

精密称取龙胆苦苷对照品5.09 mg，置于25 mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并定容至刻度，即制得浓度为0.204 mg/mL的龙胆苦苷对照品溶液。精密移取龙胆苦苷对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分别置于25 mL容量瓶中，依次编号为1、2、3、4、5，加无水乙醇溶解并定容至刻度。以不加龙胆苦苷的试剂溶液为空白，用紫外-可见分光光度计，在272 nm处测定吸光度值（A），以浓度（C）作为标准曲线横坐标（x），吸光度（A）为标准曲线纵坐标（y），绘制标准曲线并得到线性回归方程y=0.0345x-0.0182，相关系数R 2=0.99868。见图2。

图2 龙胆苦苷标准曲线

2.5 单因素实验结果及分析

2.5.1 乙醇体积分数对秦艽中黄酮和环烯醚萜苷提取率的影响

精密称取秦艽粉末5份，每份1.0 g，根据“2.1”方法进行提取。设定料液比为1∶15 g/mL，提取时间20 min，提取温度30℃，超声功率100 W，乙醇体积分数为20%、40%、60%、80%、100%，探究乙醇体积分数不同水平下黄酮及环烯醚萜苷提取率。

当乙醇体积分数低于60%时，黄酮和环烯醚萜苷提取率呈上升趋势；乙醇体积分数达60%时，秦艽提取率达峰值；但乙醇体积分数为60%～100%时提取率呈下降趋势。原因可能与秦艽中黄酮或环烯醚萜苷的化合物相对极性有关，因乙醇体积分数升高，秦艽中黄酮或环烯醚萜苷类化合物溶出度降低，因此，选择乙醇体积分数为60%。见图3。

图3 乙醇体积分数对秦艽中黄酮和环烯醚萜苷提取率的影响

2.5.2 料液比对秦艽中黄酮和环烯醚萜苷提取率的影响

精密称取秦艽粉末6份，每份1.0 g，根据“2.1”方法进行提取。设置乙醇体积分数为60%，提取时间20 min，提取温度30℃，超声功率100 W，料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL，考察在料液比为自变量情况下，秦艽中黄酮和环烯醚萜苷提取率。

黄酮提取率料液比为1∶25 g/mL时达峰值；环烯醚萜苷提取率料液比小于1∶25 g/mL时，随料液比的增大而增高，料液比为1∶30 g/mL和1∶25 g/mL时提取率相差不大，料液比大于1∶30 g/mL提取率降低，考虑到料液比的增加会造成提取剂的浪费，故选择料液比为1∶25 g/mL。见图4。

图4 料液比对秦艽中黄酮和环烯醚萜苷提取率的影响

2.5.3 提取时间对秦艽中黄酮和环烯醚萜苷提取率的影响

精密称取秦艽粉末6份，每份1.0 g，按照“2.1”方法进行提取。设置乙醇体积分数为60%，料液比1∶25 g/mL，提取温度30℃，超声功率100 W，提取时间为20、25、30、35、40、45 min，探究在提取时间不同水平下，黄酮及环烯醚萜苷的提取率。

当提取时间为35 min时，秦艽中黄酮和环烯醚萜苷的提取率达峰值。原因可能是时间的延长有利于溶剂与溶质反应，若过久则会损坏物质的组织结构，从而影响黄酮和环烯醚萜苷的提取率，所以最佳提取时间为35 min。见图5。

图5 提取时间对秦艽中黄酮和环烯醚萜苷提取率的影响

2.5.4 提取温度对秦艽中黄酮和环烯醚萜苷提取率的影响

精密称取秦艽粉末5份，每份1.0 g，按照“2.1”方法进行提取。设置乙醇体积分数为60%，料液比1∶25 g/mL，提取时间35 min，超声功率100 W，提取温度为30、40、50、60、70℃，考察在提取温度为自变量情况下，秦艽中黄酮和环烯醚萜苷提取率。

提取温度为30～60℃时，秦艽中黄酮和环烯醚萜苷的提取率呈上升趋势，当达到60℃时出现最大值，这可能是温度的升高有助于提取剂对溶质的作用，60℃后呈下降趋势，可能是因为生物活性被破坏，降低提取率，综合考虑最适宜的提取温度为60℃。见图6。

图6 提取温度对秦艽中黄酮和环烯醚萜苷提取率的影响

2.5.5 超声功率对秦艽中黄酮和环烯醚萜苷提取率的影响

精密称取秦艽粉末5份，每份1.0 g，按照“2.1”方法进行提取。设置乙醇体积分数为60%，料液比1∶25 g/mL，提取时间35 min，提取温度60℃，超声功率为100、200、300、400、500 W，探究在超声功率为自变量情况下，秦艽中黄酮和环烯醚萜苷提取率。

当超声功率低于300 W时提取率呈上升趋势，300 W之后呈下降趋势，可能是超声功率过高产生热效应，导致黄酮和环烯醚萜苷类物质结构破坏，降低提取率，故应选择超声功率为300W。见图7。

图7 超声功率对秦艽中黄酮和环烯醚萜苷提取率的影响

2.6 正交-满意度函数法优化

运用正交-满意度函数法对秦艽黄酮和环烯醚萜苷的提取工艺进行分析，秦艽提取工艺影响因素大小顺序为：乙醇浓度>提取温度>提取时间>料液比，最佳工艺组合为A2B3C2D3，即乙醇体积分数60%，料液比1∶30 g/mL，提取温度60℃，提取时间40 min。见表2—3。

2.7 验证试验

按照上述最佳提取工艺，取秦艽药材平行提取3份。测定药材中黄酮和环烯醚萜苷的含量，计算满意度值。见表4。

表2 试验设计及结果

表3 方差分析

表4 验证试验

3、讨论

本试验在单因素试验的基础上，采用正交-满意度函数设计，优化秦艽黄酮和环烯醚萜苷提取工艺，考察乙醇浓度、料液比、提取温度及提取时间对提取率的影响。结果显示，乙醇浓度对秦艽黄酮和环烯醚萜苷提取率的影响具有显著性，提取温度、料液比、提取时间也对提取率具有影响，通过正交-满意度函数优化得到的最佳工艺条件为乙醇浓度60%，料液比1∶30 g/mL，提取温度60℃，提取时间40 min。在此条件下，秦艽黄酮和环烯醚萜苷提取的平均满意度值为0.997。选用满意度值作为评价指标进行秦艽黄酮和环烯醚萜苷提取工艺优选，可部分消除各因素间的交互影响，所得提取工艺参数更加可靠。

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