非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是目前全球最常见的慢性肝病，普通成人NAFLD患病率约为6.3%～45%[1]。NAFLD是一种代谢应激性肝损伤，目前尚无特效治疗药物[2]。三七脂肝丸是目前临床用于治疗NAFLD,且具有循证医学证据的中成药之一[3],但其作用机制尚不清晰。本实验使用高脂饮食诱导NAFLD大鼠模型，观察三七脂肝丸对模型大鼠的药效，并从肝脏脂肪酸摄入、脂肪酸从头合成以及肠道紧密连接角度，探索三七脂肝丸治疗NAFLD的作用机制。

1、材料

1.1 动物

SPF级雄性Wistar大鼠48只，体质量180～200 g, 购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物生产许可证号SCXK(沪)2017-0005],饲养于上海中医药大学实验动物中心，恒温23～24 ℃,相对湿度(60±10)%,昼夜节律控制，自由饮水。本研究动物实验经上海中医药大学动物伦理委员会审批通过(伦理号PZSHUTCM200703012)。

1.2 试剂与药物

高脂饲料(批号20200806,南通特洛菲饲料科技有限公司)。三七脂肝丸(国药准字Z20025353,批号20181105,云南玉药生物制药有限公司);奥贝胆酸(批号20200707,国药集团化学试剂有限公司)。血清肝功能生化试剂盒(南京建成生物工程研究所);脂肪酸转位酶(cluster of differentiation 36,CD36)、硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-CoA desaturase-1,SCD-1)抗体(货号ab252922、ab19862,英国Abcam公司);脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)、乙酰辅酶A羟化酶(acetyl-coA carboxylase, ACC1)抗体(货号3180、4190,美国CST公司);固醇调节元件结合蛋白1c(sterol regulatory element-binding protein 1c, SREBP-1c)抗体(货号sc13551,美国Santa Cruz公司);闭锁小带蛋白1(zonula occludens-1,ZO-1)、咬合蛋白(Occludin)抗体(货号61-7300、33-1500,美国Thermo Fisher Scientific公司);β-肌动蛋白(β-actin)抗体(货号66009-1,美国Proteintech公司);辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、BCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒(货号A0208、A0216、P0012S、P0012AC,上海碧云天生物技术有限公司)。

1.3 仪器

TBA-40FR全自动生化仪(日本东芝公司);Tissuelyser-24全自动快速样品研磨仪(上海净信实业发展有限公司);Infinite M200 PRO酶标仪(瑞士Tecan公司);Fresco17低温离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司);MTC-100恒温混匀仪(杭州米欧仪器有限公司);Tanon-3500全自动数码凝胶成像分析系统(上海天能科技有限公司);RO lab/RO DI实验室纯水系统(上海和泰仪器有限公司)。

2、方法

2.1 分组、造模与给药

将48只大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常组、模型组、奥贝胆酸组和三七脂肝丸低、中、高剂量组，每组8只。除正常组外，其余各组使用高脂饲料喂养12周诱导NAFLD大鼠模型[4,5]。第9周起，正常组和模型组大鼠灌胃给予10 mL/kg去离子水；三七脂肝丸低、中、高剂量组分别灌胃给予0.77、1.54、3.08 g/kg(临床等效剂量的0.5、1、2倍)三七脂肝丸混悬液；奥贝胆酸组灌胃给予0.514 mg/kg奥贝胆酸，以每天10 mL/kg容量灌胃。

2.2 取材

12周后处死所有大鼠，采集全血和肝、回肠组织。全血4 ℃静置3 h, 1 000 ×g离心15 min, 分装血清。采集肝脏，称重，留取肝、回肠组织标本。肝脏取相同部位组织浸入中性福尔马林溶液中固定。肝、回肠组织分装在冻存管中，于-80 ℃保存备用。

2.3 组织病理学检测

肝组织经脱水、包埋、切片后，分别行HE、油红O染色，于光学显微镜下观察肝组织病理学变化。通过Image Pro plus 6.0软件分析油红O阳性染色面积比值。

2.4 血清、肝组织生化指标检测

采用全自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)、总胆固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-c)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-c)、游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)水平；试剂盒法检测肝组织TG、FFA水平。

2.5 Western blot法检测肝组织脂肪合成、代谢相关蛋白以及回肠紧密连接蛋白表达

将40～50 mg肝、回肠组织裂解后取上清，BCA法蛋白定量后，SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，孵育抗体，显影成像。

2.6 统计学分析

通过SPSS 24.0软件进行处理，计量资料以(x¯±s)表示，符合正态分布及方差齐性者，组间比较采用单因素方差分析；方差不齐者，组间比较采用非参数检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1 大鼠一般情况

模型复制过程中，正常组大鼠体质量逐渐增加，毛色光泽，饮食、二便正常，精神状态良好；模型组大鼠体质量快速增加，毛色光泽油亮，精神状态良好。造模及给药结束后，与正常组比较，模型组大鼠体质量、肝质量、肝指数均升高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较，三七脂肝丸各剂量组和奥贝胆酸组大鼠体质量、肝质量降低(P<0.05,P<0.01),三七脂肝丸中、高剂量组肝指数降低(P<0.05),见表1。

表1 三七脂肝丸对大鼠体质量、肝质量、肝指数的影响(x¯¯±s,n=8)

3.2 三七脂肝丸对NAFLD大鼠血清肝功能的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清ALT、AST活性升高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较，三七脂肝丸各剂量组和奥贝胆酸组大鼠血清ALT、AST活性降低(P<0.05,P<0.01),见表2。

3.3 三七脂肝丸对NAFLD大鼠血清脂质水平的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清TC、TG、LDL-c、FFA水平升高(P<0.05,P<0.01),HDL-c水平降低(P<0.01);与模型组比较，三七脂肝丸各剂量组和奥贝胆酸组大鼠血清FFA水平降低(P<0.05),三七脂肝丸中、高剂量组和奥贝胆酸组大鼠血清TC、TG水平降低(P<0.05,P<0.01),三七脂肝丸高剂量组大鼠血清LDL-c水平降低(P<0.01),奥贝胆酸组大鼠血清HDL-c水平升高(P<0.01);与奥贝胆酸组比较，三七脂肝丸高剂量组血清LDL-c水平降低(P<0.01),见表3。

表2 三七脂肝丸对NAFLD大鼠血清肝功能的影响(IU/L,x¯¯±s,n=8)

3.4 三七脂肝丸对NAFLD大鼠肝组织FFA、TG水平的影响

与正常组比较，模型组大鼠肝组织FFA、TG水平升高(P<0.01);与模型组比较，三七脂肝丸中、高剂量组大鼠肝组织FFA、TG水平降低(P<0.05,P<0.01),奥贝胆酸组大鼠肝组织TG水平降低(P<0.01);与奥贝胆酸组比较，三七脂肝丸中、高剂量组大鼠肝组织FFA水平降低(P<0.05),见表4。

表3 三七脂肝丸对NAFLD大鼠血清脂质水平的影响(mmol/L,x¯¯±s,n=8)

表4 三七脂肝丸对NAFLD大鼠肝组织FFA、TG水平的影响(mmol/g,x¯¯±s,n=8)

3.5 三七脂肝丸对NAFLD大鼠肝组织病理学的影响

HE染色显示，正常组大鼠肝细胞形态正常，肝索排列整齐，肝小叶结构完整，未见炎性细胞浸润；与正常组比较，模型组大鼠肝脏可见大小泡混合性肝细胞脂肪变性，伴有小叶内炎性细胞浸润，其肝细胞脂肪变、小叶内炎症、气球样变以及NAS积分升高(P<0.01),符合NAFLD的诊断标准[2,6];与模型组比较，三七脂肝丸各剂量组和奥贝胆酸组大鼠肝脏脂肪变性及细胞浸润情况均有所改善，其中三七脂肝丸高剂量组和奥贝胆酸组肝细胞脂肪变、小叶内炎症、气球样变以及NAS积分降低(P<0.05,P<0.01),三七脂肝丸中剂量组肝细胞脂肪变、小叶内炎症以及NAS积分降低(P<0.05,P<0.01),见图1、表5。

图1 各组大鼠肝组织HE染色(×400)   

油红O染色显示，正常组大鼠肝组织未见红色脂肪滴；与正常组比较，模型组大鼠肝组织可见脂肪浸润，油红O阳染面积比升高(P<0.01);与模型组比较，三七脂肝丸各剂量组和奥贝胆酸组肝组织脂肪浸润减轻，其中三七脂肝丸中、高剂量组和奥贝胆酸组油红O阳染面积比降低(P<0.01),见图2、见表5。

表5 三七脂肝丸对NAFLD大鼠肝组织NAS病理评分及油红O阳染面积比的影响(x¯¯±s,n=8)

图2 各组大鼠肝组织油红O染色(×200)   

3.6 三七脂肝丸对NAFLD大鼠肝组织FAS、ACC1、SREBP-1c、CD36、SCD-1蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠肝组织FAS、ACC1、SREBP-1c、CD36蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01),SCD-1蛋白表达降低(P<0.05);与模型组比较，三七脂肝丸中、高剂量组大鼠肝组织FAS、ACC1、SREBP-1c、CD36蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),SCD-1蛋白表达升高(P<0.01),三七脂肝丸低剂量组大鼠肝组织SREBP-1c、CD36蛋白表达降低(P<0.01),奥贝胆酸组大鼠肝组织FAS、ACC1、SREBP-1c、CD36蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01);与奥贝胆酸组比较，三七脂肝丸中剂量组肝组织FAS蛋白表达降低(P<0.01),三七脂肝丸中、高剂量组肝组织SCD-1蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01),见图3。

3.7 三七脂肝丸对NAFLD大鼠回肠组织ZO-1、Occludin蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠回肠组织ZO-1、Occludin蛋白表达降低(P<0.01);与模型组比较，三七脂肝丸高剂量组和奥贝胆酸组回肠组织ZO-1、Occludin蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01),见图4。

4、讨论

肝脏是调节脂质代谢稳态的重要器官，负责脂肪酸摄入、脂肪酸从头合成(de novo lipogenesis, DNL)、脂肪酸氧化和脂质输出。当脂肪酸的摄入、合成超过氧化和输出时，肝细胞TG过度蓄积是NAFLD的主要病理特征。中医认为，NAFLD的病机是肝失疏泄、脾失健运[3],根据临床表现，治法上多以健脾化痰、清热利湿、疏肝理气为主[4,5]。三七脂肪丸的主要成分包括三七、莪术、云山楂、泽泻、菊花等，具有健脾化浊、祛痰软坚的功效，可治疗肝郁脾虚型脂肪肝。临床表明，三七脂肝丸能够降低NAFLD患者血脂水平，改善肝功能[6,7]。本实验观察到模型大鼠肝组织脂肪浸润，血清ALT、AST活性及TC、TG、LDL-c、FFA水平升高，肝组织TG、FFA水平升高，与文献报道一致[8,9]。三七脂肝丸中、高剂量组大鼠肝组织TG、FFA水平降低，脂肪浸润减轻，提示三七脂肝丸能够改善NAFLD大鼠脂质代谢状态。

图3 三七脂肝丸对NAFLD大鼠肝组织FAS、ACC1、SREBP-1c、CD36、SCD-1蛋白表达的影响(x¯¯±s,n=8)

图4 三七脂肝丸对NAFLD大鼠回肠组织ZO-1、Occludin蛋白表达的影响(x¯¯±s,n=8)

肝脏脂肪酸主要来源于CD36摄取的肝外游离脂肪酸和肝脏DNL[10]。肝脏DNL失调是NAFLD形成的中心事件[11]。DNL过程中脂肪酸生成的关键酶ACC和FAS,均由SREBP-1c转录调控[12]。SREBP-1c表达增加能够上调ACC和FAS表达，促进脂肪酸合成。ACC催化乙酰辅酶A生成丙二酰辅酶A,不仅为长链脂肪酸合成提供底物，还可变构抑制线粒体膜上的肉碱棕榈酰转移酶，降低线粒体的脂肪酸β氧化。SCD-1是催化饱和脂肪酸向单不饱和脂肪酸转化的关键限速酶，其催化产物单不饱和脂肪酸是甘油三酯生成的重要底物[13]。SCD-1的去饱和作用将具有促炎作用的饱和脂肪酸转化为低脂毒性的单不饱和脂肪酸；其表达减少或活性过低会导致高脂毒性的饱和脂肪酸积累，促进炎症反应[14]。本实验发现，三七脂肝丸中、高剂量组大鼠肝组织CD36、SREBP-1c、ACC1和FAS表达降低，SCD-1表达升高，提示三七脂肝丸能够减少肝细胞的脂肪酸摄入，抑制DNL,促进高脂毒性的饱和脂肪酸转化，减轻炎症反应。

除肝脏DNL失调外，肠道黏膜屏障破坏也被认为是NAFLD发生发展的重要因素[12]。肠道黏膜机械屏障破坏、通透性增加，肠内细菌及微生物移位，脂多糖等外源性毒素进入门静脉，引发炎症反应，导致肝细胞脂肪变性，是NAFLD发病机制中的重要环节[15]。肠道黏膜机械屏障由肠上皮细胞及细胞间的紧密连接组成。肠紧密连接在调节肠道黏膜通透性方面具有重要作用，由闭合蛋白Claudin、Occludin和连接黏附分子3种膜蛋白以及ZO-1、ZO-2和ZO-3等外周浆蛋白组成。ZO-1蛋白与紧密连接的功能变化密切相关，被作为评价紧密连接通透性的指标[16]。而缺乏Occludin则不能形成典型的紧密连接结构[17,18]。临床研究发现，NAFLD患者小肠紧密连接蛋白ZO-1、Occludin表达降低[19]。动物实验也证实，NAFLD大鼠小肠组织ZO-1和Occludin蛋白表达降低，肠道黏膜机械屏障受损，通透性增加[20,21]。本实验结果显示，模型组大鼠小肠ZO-1和Occludin蛋白表达均较正常组降低，与文献报道一致。三七脂肝丸高剂量组大鼠小肠ZO-1和Occludin蛋白表达较模型组升高，提示高剂量三七脂肝丸能够改善NAFLD肠道黏膜机械屏障功能。

综上所述，三七脂肝丸能够改善NAFLD大鼠血清肝功能、脂质水平、肝细胞脂肪变及肠道黏膜机械屏障损伤，其作用机制可能与调节肝脏脂肪酸摄入、脂肪酸从头合成，降低脂肪酸脂毒性的相关蛋白以及肠紧密连接蛋白表达密切相关。

参考文献:

[2]中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组,中国医师协会脂肪性肝病专家委员会.非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018年更新版)[J].临床肝胆病杂志,2018,34(5):947-957.

[3]刘平.中成药临床应用指南肝胆疾病分册[M].中国中医药出版社,2017:103-111.

[4]刘莉丹,刘晏.健脾利湿法治疗非酒精性脂肪肝的研究进展[J].中成药,2021,43(9):2452-2456.

[5]李军祥,陈治水,危北海.非酒精性脂肪性肝病的中西医结合诊疗共识意见[J].中国中西医结合杂志,2011,31(2):155-158.

[6]罗丹,江玉.三七脂肝丸治疗非酒精性脂肪肝肝功能异常59例[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(5):202-205.

[7]方翠艳,唐明会,赵静媛,等.三七脂肝丸对非酒精性脂肪肝患者肝纤维化指标的影响[J].中国伤残医学,2013,21(11):240.

[9]赵旦博,任婷婷,禹萍,等.蓝莓对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝组织γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚基蛋白表达的影响[J].中西医结合肝病杂志,2016,26(2):102-104;106;131.

[11]邵幼林,范建高.非酒精性脂肪性肝病患者肝脏脂肪的来源与去路[J].国际消化病杂志,2019,39(5):316-320.

[13]陈成,胡义扬,冯琴.硬脂酰辅酶A去饱和酶1在肥胖和非酒精性脂肪性肝病中的研究进展[J].中华肝脏病杂志,2018,26(7):545-548.

[15]张玮,李华南,骆雄飞,等.非酒精性脂肪性肝病肠道黏膜机械屏障功能的研究进展[J].国际生物医学工程杂志,2020,43(5):394-399;411.

[18]张毅靖,甘剑峰,王永福,等.健脾祛湿膏对大鼠胃肠功能的调节作用[J].中成药,2021,43(1):191-195.

[20]任卫英,沈继平,潘刚,等.非酒精性脂肪肝大鼠小肠黏膜上皮屏障及紧密连接蛋白表达的变化[J].中华临床医师杂志(电子版),2013,7(13):5975-5979.

[21]许腊梅,孙丹莉,张予蜀.非酒精性脂肪性肝病大鼠肠上皮细胞间紧密连接的变化及Occludin的表达[J].胃肠病学和肝病学杂志,2010,19(5):423-426.

基金资助:国家自然科学基金面上项目(81774196);

文章来源:郭真,王伊雯,戚莉等.三七脂肝丸对非酒精性脂肪性肝病大鼠脂肪酸代谢的影响[J].中成药,2023,45(11):3758-3763.