胶质母细胞瘤（glioblastoma,GBM）又称恶性胶质瘤，是中枢神经系统常见的原发性恶性肿瘤，约占所有中枢神经系统肿瘤的33%，具有恶性程度高、致死率高、复发率高的特点[1,2]。目前，GBM的临床治疗以手术治疗联合放疗及替莫唑胺化疗的传统疗法为主，但该疗法不良反应大，患者易出现化疗耐药且预后较差[2]，因此迫切需要寻找高效、低毒的辅助药物或替代疗法。

近年来，天然产物在肿瘤研究领域扮演了重要角色。藜芦胺（veratramine,VTM）为甾体生物碱类成分，是百合科植物藜芦的有效成分之一。体外研究表明，VTM可通过诱导肿瘤细胞自噬、凋亡来抑制其增殖[3,4]。铁死亡是一种由铁依赖性脂质活性氧（reactive oxygen species,ROS）异常累积所引发的非凋亡性程序性死亡方式，与恶性肿瘤、神经退行性疾病等多种疾病密切相关，并在肿瘤细胞生长、耐药等方面发挥着重要作用[5]。本课题组前期预实验证实，VTM可抑制GBM细胞的增殖，但这种作用是否与铁死亡过程有关以及其具体作用机制尚不清楚。为此，本研究拟通过网络药理学方法预测VTM作用于GBM的潜在靶点、基因功能及信号通路；同时，拟借助体外细胞实验，初步验证该成分通过诱导铁死亡来抑制GBM细胞活性的可能机制，以期为GBM治疗和新药研究提供新思路。

1、材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器包括3111型CO2细胞培养箱、EVOSF1型荧光显微镜（美国Thermo Fisher Scientific公司），CKX41型光学倒置显微镜（日本Olympus公司），STNERGYH1型酶标仪（美国Agilent公司），C6型流式细胞仪（美国BD公司），165-8001型蛋白电泳仪、ChemⅠDoc型超高灵敏度化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司）等。

1.2 主要药品与试剂

VTM原料药（批号HY-N0837，纯度99.61%）、CCK-8试剂盒（批号HY-K0301）均购自美国Med Chem Express公司；DMEM高糖培养基（批号2327860）、胎牛血清（批号10091148）均购自美国Gibco公司；4%多聚甲醛固定液（批号P0099）、结晶紫染色液（批号C0121）、胰酶消化液（批号C0201）、Western blot细胞裂解液（批号P0031）、BCA蛋白浓度测定试剂盒增强型（批号P0009）、2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）荧光探针（批号S0033）均购自上海碧云天生物技术有限公司；FerroOrange荧光探针（批号F374）购自东仁化学科技（上海）有限公司；兔源谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxi‐dase 4,GPX4）单克隆抗体（批号T56959）购自艾比玛特医药科技（上海）有限公司；兔源血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1）单克隆抗体（批号ab214039）、兔源核转录因子红系2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2）单克隆抗体（批号ab137550）均购自英国Abcam公司；兔源甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体（批号2118S）购自美国CST公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔Ig G二抗（批号ZB-2306）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 细胞

人GBM细胞U251购自美国ATCC菌种保藏中心。

2、方法与结果

2.1 网络药理学分析

2.1.1 VTM作用靶点预测

以“VTM”为关键词，在Pharm Mapper数据库、Swiss Target Prediction数据库、Target Net数据库、Batman-TCM数据库中检索其可能的作用靶点，合并、去重后，共筛选得到VTM预测靶点16 397个。

2.1.2 GBM和铁死亡相关靶点获取

以“glioblastoma”“glioma”为关键词，在CTD数据库、Drug Bank数据库、Gene Cards数据库、OMIM数据库、Pharm GKB数据库、TTD数据库中进行检索，并在Pub Med数据库中进行补充检索，合并、去重后，共得到GBM疾病相关靶点5 865个。通过Ferr Db数据库获取铁死亡相关靶点（ferroptosis-related genes,FRGs)1 043个。

2.1.3 VTM干预靶点的获取及富集分析

将上述获取到的药物预测靶点、疾病相关靶点、FRGs进行交叉，利用R语言的“Venn”包进行分析，获取VTM干预GBM的铁死亡相关交集靶点462个。利用Uni Prot数据库对上述交集靶点进行标准化校正，运用R语言的“Cluster Profiler”包进行基因本体（gene ontology,GO）功能富集分析以及京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）信号通路富集分析，以P<0.05为条件进行筛选并对富集基因数与总基因数的比值（简称“富集基因占比”）进行排序（由大到小），再运用“ggplot2”包对富集分析结果进行可视化展示，得到VTM干预GBM的主要功能及可能途径。

GO功能富集结果（图1）显示，VTM干预GBM的生物学过程（biological process,BP）主要涉及氧化应激、细胞凋亡、对金属离子的响应、自噬调节等；细胞成分（cel‐lular components,CC）主要涉及胞质囊泡、线粒体膜、细胞膜和核糖体等部位；分子功能（molecular function,MF）主要包括影响二价铁离子（Fe2+）结合、DNA转录过程和多个氧化还原酶活性等。

KEGG富集结果（图2）显示，VTM干预GBM主要涉及铁死亡、磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase,PI3K）/蛋白激酶B(protein kinase B，又称Akt）、自噬、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of ra‐pamycin,m TOR）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）、细胞凋亡等信号通路。

GO和KEGG富集分析结果显示，VTM干预GBM涉及多条信号通路，其中氧化应激和铁死亡信号通路均排名靠前。基于此，本研究选择与氧化应激、铁死亡均相关的信号通路Nrf2/HO-1/GPX4[6,7,8,9]作为后续研究的重点。

图1 VTM干预GBM的GO功能富集结果气泡图（富集基因占比排名前15位）  

2.2 体外细胞实验

2.2.1 细胞培养

将U251细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，于37℃、5%CO2条件下培养，隔天换液传代，取对数生长期细胞进行后续实验。

2.2.2 细胞存活率检测

采用CCK-8法进行检测。取对数生长期的U251细胞，按5 000个/孔接种于96孔板中，按“2.2.1”项下方法常规培养过夜。将细胞分为对照组（VTM 0μmol/L）和VTM不同浓度组（40、60、80、100、120、140μmol/L，浓度参考相关文献[4]设置），并设置不加药物、不加细胞的空白组，每组设3个复孔。培养24 h后，每孔加入CCK-8工作液10μL，孵育1 h。使用酶标仪于450 nm波长处检测各孔的光密度（OD）值并按下式计算细胞存活率：细胞存活率=（OD实验组-OD空白组）/（OD对照组-OD空白组）×100%。采用Graph Pad Prism 8.3.0软件对数据进行统计分析，实验数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05（统计方法下同）。结果（图3）显示，与对照组比较，VTM各浓度组的细胞存活率均显著降低（P<0.01），且有一定的浓度依赖趋势。

图2 VTM干预GBM的KEGG富集结果柱状图（富集基因占比排名前10位）  

图3 不同浓度VTM对U251细胞存活率的影响   

2.2.3 细胞克隆形成能力检测

采用细胞克隆形成实验进行检测。取对数生长期的U251细胞，按500个/孔接种于6孔板中，常规培养过夜。将细胞分为对照组和VTM不同浓度组（40、80、120μmol/L，浓度参考“2.2.2”项下实验结果设置），每组设3个复孔。培养24 h后，弃去培养基，加入新鲜培养基，培养14 d；弃去培养基，细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，置于4%多聚甲醛固定液中固定20 min，随后用0.1%结晶紫染色液染色30 min，用PBS洗涤后自然干燥，拍照并观察细胞克隆形成情况，按下式计算细胞克隆形成率：细胞克隆形成率=集落形成数/每孔细胞总数×100%（细胞数>50为1个集落）。结果（图4）显示，80、120μmol/L的VTM均可显著抑制U251细胞的克隆形成（P<0.05或P<0.01）。

图4 VTM对U251细胞克隆形成能力的影响   

2.2.4 细胞形态变化观察

取对数生长期的U251细胞，按1.5×105个/孔接种于6孔板中，常规培养过夜。细胞按“2.2.3”项下方法进行分组、处理。培养24 h后，使用倒置显微镜观察各组细胞的形态变化。结果（图5）显示，相较于对照组细胞，VTM各浓度组细胞的排列明显更为松散，可见细胞明显萎缩，并伴有大量漂浮的死亡细胞，且VTM作用浓度越大，其对细胞形态的影响越明显。

2.2.5 细胞内ROS水平检测

采用DCFH-DA荧光探针法进行检测。取对数生长期的U251细胞，按1.5×105个/孔接种于6孔板中，常规培养过夜。细胞按“2.2.3”项下方法进行分组、处理。培养24 h后，弃去培养液，细胞用PBS洗涤3次后，加入DCFH-DA荧光探针（10μmol/L），常规孵育30 min；用PBS洗涤3次后，置于荧光显微镜下观察各孔的荧光（绿色）变化情况并使用Image J软件计算其荧光相对强度，用以表示细胞内ROS水平。结果（图6）显示，与对照组比较，VTM各浓度组细胞内的绿色荧光均有所增强，其ROS水平均显著升高（P<0.05或P<0.01），有一定的浓度依赖趋势。

2.2.6 细胞内Fe2+水平检测

采用Ferro Orange荧光探针法进行检测。取对数生长期的U251细胞，按2×105个/孔接种于6孔板中，常规培养过夜。细胞按“2.2.3”项下方法进行分组、处理。培养24 h后，弃去培养液，细胞用无血清培养基洗涤3次后，加入Ferro Orange荧光探针（1μmol/L），常规孵育30min后，置于荧光显微镜下观察各孔的荧光（红色）变化情况并使用Image J软件计算其相对荧光强度，用以表示细胞内Fe2+水平。结果（图7）显示，与对照组比较，VTM各浓度组细胞内的红色荧光均有所增强，其Fe2+水平均显著升高（P<0.01），有一定的浓度依赖趋势。

2.2.7 细胞内铁死亡通路Nrf2/HO-1/GPX4相关蛋白表达的检测

采用Western blot法进行检测。取对数生长期的U251细胞，按2×106个/皿接种于100 mm培养皿中，常规培养过夜。细胞按“2.2.3”项下方法进行分组、处理。培养24 h后，裂解提取全细胞蛋白并以BCA法测定蛋白浓度。取变性后的蛋白样品适量，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脱脂牛奶室温封闭1 h；以TBST缓冲液洗膜后，加入Nrf2、HO-1、GPX4、GAPDH一抗（稀释比例均为1∶1 000），于4℃下孵育过夜；以TBST缓冲液洗膜后，加入相应二抗（稀释比例为1∶5 000），于37℃下孵育1 h；以TBST缓冲液洗膜后，用ECL显影液显色，于化学发光成像系统下曝光成像。使用Image J软件进行分析，以目的蛋白与内参蛋白（GAPDH）的灰度值比值作为各目的蛋白的表达水平。结果（图8）显示，与对照组比较，VTM 80、120μmol/L组细胞内GPX4蛋白的表达水平均显著降低（P<0.01),VTM 120μmol/L组细胞内Nrf2蛋白和VTM各浓度组细胞内HO-1蛋白的表达水平均显著升高（P<0.05或P<0.01），上述作用有一定的浓度依赖趋势。

图5 VTM对U251细胞形态影响的显微图   

图6 VTM对U251细胞内ROS水平的影响   

Ⅰ：对照组的ROS表达荧光图；Ⅱ：VTM 40μmol/L组的ROS表达荧光图；Ⅲ：VTM 80μmo/L组的ROS表达荧光图；Ⅳ：VTM 120μmol/L组的ROS表达荧光图；Ⅴ：各组细胞的ROS水平柱形图；a：与对照组比较，P<0.05;b：与对照组比较，P<0.01。

图7 VTM对U251细胞内Fe2+水平的影响   

图8 VTM对U251细胞内铁死亡通路相关蛋白表达的影响   

3、讨论

GBM是恶性程度高、侵袭性强、致死率高的中枢神经系统恶性肿瘤，严重影响患者的生存质量[1]。考虑到现有疗法的局限性，挖掘靶向抑制GBM细胞增殖的药物对改善患者预后具有重要的临床意义。

本研究在前期预实验基础上，首先借助网络药理学手段，筛选得到了VTM干预GBM的铁死亡相关交集靶点462个；随后的GO功能富集结果显示，VTM干预GBM的CC包括胞质囊泡、线粒体膜等，MF涉及Fe2+结合、DNA转录过程等，BP以氧化应激、细胞凋亡等为主；进一步的KEGG富集结果显示，VTM干预GBM的作用靶点分布于铁死亡、PI3K/Akt等信号通路。上述结果提示，VTM对GBM的干预作用可能是通过激活氧化应激、铁死亡等信号通路来实现的。基于此推测，本研究结合交集靶点分析及铁死亡相关研究结果[6,7,8,9]，选取Nrf2/HO-1/GPX4信号通路进行初步验证。

本研究通过CCK-8法、细胞克隆形成实验、细胞形态变化观察发现，不同浓度的VTM可不同程度地抑制U251细胞的增殖和克隆形成，并可造成细胞萎缩、细胞核破碎等，上述作用有一定的浓度依赖趋势，初步确定了VTM对U251细胞活性的抑制作用。研究指出，铁死亡不仅是GBM细胞程序性死亡过程中的主要类型[7]，而且可影响脑胶质瘤患者的药物治疗效果及预后，还可影响神经退行性疾病的病理过程[8,9]，提示铁死亡可作为神经肿瘤、神经系统疾病治疗和新药研发的关键靶点。作为一种细胞死亡方式，铁死亡与其他死亡方式的区别在于，铁死亡涉及了铁代谢和脂质ROS蓄积的过程，Fe2+可通过芬顿反应来诱导细胞内ROS的蓄积，从而诱导铁死亡的发生[5]。为了验证VTM能否通过铁死亡来抑制GBM细胞活性，本研究采用DCFH-DA和Ferro Orange荧光探针法分别检测了VTM作用后细胞内ROS和Fe2+水平，结果显示，二者荧光强度均明显增强，提示VTM可诱导细胞内ROS和Fe2+的蓄积，且有浓度依赖趋势。

近期多项研究表明，Nrf2/HO-1/GPX4信号通路与铁死亡通路调控密切相关。其中，Nrf2、HO-1是抗氧化系统的主要调控因子，同时也在涉及铁死亡的铁代谢、脂质代谢等过程中发挥了重要作用[10,11,12,13]。研究指出，作为调节氧化还原稳态的重要蛋白，Nrf2的异常表达可导致脂质氧化及铁死亡的发生[14]；同时，Nrf2可在上游调节HO-1蛋白的表达，以启动对细胞的保护作用，可通过调控GPX4蛋白的表达，进而影响细胞铁死亡进程[15]。此外，作为细胞抗氧化活性的重要调节因子，Nrf2还具有一定的双重作用：在正常情况下，该蛋白的表达水平较低，被激活后可抑制肿瘤的形成；在病理条件下，Nrf2能促进肿瘤细胞的增殖及转移，减轻化疗药物导致的氧化应激损伤，阻止肿瘤细胞凋亡、自噬并促进耐药，从而影响患者预后[16,17]。有研究发现，Nrf2在高级别胶质瘤细胞中有更高的表达，可作为胶质瘤病理分析的标志物[18]。GPX4是一种启动内源性抗氧化反应元件的转录因子，也是铁死亡的重要调节因子，可保护细胞免受ROS蓄积所致的氧化损伤，维持细胞脂质稳态；当GPX4表达被抑制时，脂质过氧化物将不断蓄积，并进一步诱导铁死亡的发生[10,11,12,13]。与正常神经胶质细胞相比，人GBM细胞（U251和U87）中GPX4蛋白的表达水平更高，且该蛋白对铁死亡诱导剂的敏感性更强[19]。可见，靶向调控GPX4蛋白的表达可能是GBM治疗的有效手段，GPX4蛋白可作为潜在的肿瘤标志物。本研究的Western blot实验结果显示，与对照组比较，VTM 80、120μmol/L组细胞内GPX4蛋白的表达水平均显著降低，VTM 120μmol/L组细胞内Nrf2蛋白和VTM各浓度组细胞内HO-1蛋白的表达水平均显著升高，提示VTM可通过调控Nrf2/HO-1/GPX4信号通路来诱导U251细胞铁死亡。

笔者通过查阅近期研究发现，Nrf2、HO-1蛋白对于靶向铁死亡治疗肿瘤具有关键作用，即抑制Nrf2蛋白的过表达，可增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，逆转肿瘤细胞的耐药，促进细胞铁死亡的发生[20]；同时，HO-1蛋白可通过铁蓄积等途径来促进铁死亡的发生[21,22]。然而，VTM能否通过干预Nrf2、HO-1蛋白的过表达来影响铁死亡的过程尚需后续实验探讨。

综上所述，VTM可抑制人GBM细胞U251的增殖，促进细胞内ROS和Fe2+的蓄积，从而诱导铁死亡，上述作用可能与调控Nrf2/HO-1/GPX4信号通路有关；VTM可作为一种潜在的铁死亡诱导剂。本课题组后续将进一步结合通路抑制剂、小分子RNA干扰等方式并基于本网络药理学提示的自噬、凋亡等其他通路来完善对VTM干预GBM作用机制的探索。

参考文献:

[6]关锡梅,解勇圣,倪伟建,等.Nrf2/HO-1/GPX4对高糖诱导足细胞铁死亡的影响及小檗碱的干预机制研究[J].中国药理学通报,2021,37(3):396-403.

基金资助:重庆市研究生教育“课程思政”示范项目(No.YKCSZ23057);重庆市卫生计生委中医药科技项目(No.ZY201801004);

文章来源:曹梓珍,张琳,傅若秋等.藜芦胺对人胶质母细胞瘤细胞U251增殖的影响及机制[J].中国药房,2023,34(22):2734-2739.