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不同产地、不同炮制方式连翘的主要化学成分含量及抗菌活性比较评价

2023-12-02 139 上传者：管理员

摘要：目的对不同产地、不同炮制方式连翘的主要化学成分含量及抗菌活性进行比较评价。方法选取不同产地、不同炮制方式的连翘，通过超高效液相色谱法（ultra performance liquid chromatography, UPLC）测定连翘苷、（+）松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、芦丁、连翘酯苷A的含量；通过测定连翘煎煮液对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC），比较抗菌活性。结果相同产地清蒸连翘的（+）-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、芦丁、连翘酯苷A及连翘苷的含量均显著高于生晒连翘；在清蒸连翘中，陕西产地连翘的4种主要化学成分含量均最高；在生晒连翘中，陕西产地连翘的松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷和芦丁含量最高，而山东产地的连翘酯苷A和连翘苷含量最高。不同产地、不同炮制方式连翘煎煮液的MIC值明显不同，清蒸连翘的MIC值显著低于生晒连翘。结论利用UPLC测定连翘主要化学成分含量的方法简便、准确，可用于不同产地、不同炮制方式连翘药材的区分及质量评价；连翘煎煮液对金黄色葡萄球菌的抑制作用的测定，也为其进一步抗菌作用机制研究提供参考。

关键词：
化学成分
最小抑菌浓度
质量评价
超高效液相色谱法
连翘
金黄色葡萄球菌
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连翘为木犀科植物连翘的干燥果实，味苦、微寒，有清热解毒、疏风散结之功[1]。现代研究表明，连翘主要含苯乙醇苷类、木脂素及其苷类、五环三萜类、挥发油类等化合物，具有抗菌[2,3,4,5]、抗炎[6,7,8]、抗病毒[9,10]、神经保护[11]等药理作用。目前，连翘质量标准研究主要集中在不同地区连翘药材道地性、适宜采收期以及基于高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）和超高效液相色谱法（ultra-high performance liquid chromatography,UPLC）等指纹图谱分析[12,13,14]。

本研究收集了不同产地、不同炮制方式的连翘药材，参考相关文献[12,15]，建立了同时测定连翘中4种成分含量的UPLC，并通过测定连翘对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）来检测不同产地、不同炮制方式连翘药材的抑菌活性，分析不同产地及不同炮制方式对连翘药材质量的影响，以期为连翘的临床使用与资源开发提供参考。

1、材料与方法

1.1主要试药

（+）-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷（批号：S-029-181207）、芦丁（批号：L-001-181216）、连翘酯苷A（批号：RFS-L01211812016）、连翘苷（批号：L-010-181106），均购自成都瑞芬思生物科技有限公司，HPLC级，纯度高于98%；金黄色葡萄球菌（北纳创联生物科技有限公司）；牛肉膏（Beijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.);NaCl（上海沪试实验室器材股份有限公司）；甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；蒸馏水。药材来源见表1。

1.2主要仪器

SW-CJ-1FD超净工作台（日本AIRTECH公司）；YA28X6T/8高压蒸汽灭菌器（宁波甬安医疗器械制造有限公司）；Incucell 55 L恒温箱（MMM集团）；STIBR高速冷冻离心机（美国Thermo Scientific公司）；ACOUITY超高效液相色谱仪（Waters，配有Waters H Class分离模块，PDA光电二极管阵列检测器）；Q-POD超净纯水仪（美国Millipore公司）；SIM-F140AY65-PC自动制冰机（日本松下普和希公司）；VORTEX-5涡旋仪（其林贝尔仪器制造公司）；中药药筛80目（绍兴市上虞沪江仪器公司）；-20℃冰箱（青岛海尔集团有限公司）；800C高速多功能粉碎机（浙江永康市红太阳机电有限公司）；96孔板（浙江Sorfa生命科学研究有限公司）。

1.3主要化学成分含量测定[1,13,14,15]

1.3.1色谱条件

ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm,1.7μm）。流动相为甲醇（A）-水（B），梯度洗脱：0～3 min,A∶B=10∶90～25∶75;3～12.5 min,A∶B=25∶75～33∶67;12.5～16.5 min,A∶B=33∶67～38∶62;16.5～19.5 min,A∶B=38∶62～40∶60。检测波长235 nm，流速0.4 m L/min，进样量10μL，柱温28℃。

1.3.2对照品溶液制备

精密称取（+）松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、芦丁、连翘酯苷A、连翘苷对照品适量，置于10 m L棕色容量瓶中，加50%乙醇定容至刻度，摇匀，制成含（+）松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷0.38 g/L、芦丁0.61 g/L、连翘酯苷A1.45 g/L、连翘苷0.71 g/L的溶液混合对照品溶液。

1.3.3供试品溶液制备

取连翘粉末1.0 g（过5号筛），置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 m L，密塞，称定，超声处理（功率250 W，频率40 KHz)40 min，放冷，再称定，用甲醇补足减失质量，摇匀，离心，取上清液，0.22μm微孔滤膜过滤，上样。

1.3.4线性关系考察

精密吸取“1.2.1.2”混合对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 m L于10 m L量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，得不同浓度的混合对照品溶液。按上述色谱条件测定各组分的峰面积。以各有效成分峰面积（Y）为纵坐标，浓度（C，μg·m L-1）为横坐标，得线性方程（见表2）。该方法在较大范围内线性关系良好。

1.3.5精密度试验

精密吸取混合对照品溶液10μL，分别连续进样5次，测定峰面积，结果（+）松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、芦丁、连翘酯苷A、连翘苷峰面积的RSD分别为0.77%、0.97%、1.17%、0.50%，表明仪器精密度良好。

1.3.6稳定性实验

精密吸取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12 h进样测定峰面积，结果（+）松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、芦丁、连翘酯苷A、连翘苷峰面积RSD值分别为1.46%、1.84%、1.20%、0.78%，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

1.3.7回收率试验

采用加样回收率试验方法，精密称取已知含量的同一连翘样品0.5 g，平行6份，分别精密加入一定量的对照品溶液，按“1.2.1.3”项下方法，分别进行超声提取，过滤，注入高效液相色谱仪测定，计算回收率。（+）松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、芦丁、连翘酯苷A、连翘苷的平均回收率分别为100.28%、98.54%、99.73%、99.02%。

1.4抗菌活性测定[16,17,18]

1.4.1样品的制备

准确秤取连翘30 g，取200 m L水，与称取好的连翘共同置于砂锅中，浸泡30 min后用电陶炉加热，火力2 200 W，煮沸后调整火力到800 W，煎煮15 min,6层纱布滤出药液待用，再取200 m L水倒入锅中重复上述煎煮步骤，合并两次药液，去滓，再煎至药液剩余30 m L，终药浓度为1 g·m L-1，将样品溶液通过无菌滤膜过滤以除去杂菌，再以2倍稀释法将样品溶液用营养肉汤培养基依次稀释成8个不同的浓度，备用。

1.4.2最小抑菌浓度（minimum inhibitory concen-tration,MIC）的测定

将活化好的菌种与0.45%无菌氯化钠溶液用细菌浊度计调成0.5麦氏比浊度，即细菌浓度1×106CFU·m L-1，再将此细菌浓度稀释成2×103CFU·m L-1，然后在96孔板各微孔中分别加入不同浓度的待测液100μL和2×103CFU·m L-1的细菌100μL，在振荡器上振荡5 min，放入37℃恒温培养箱培养24 h，以肉眼观察法判定药物的MIC值，以抑制100%细菌生长时的浓度为判定终点，即MIC100。

2、结果

2.1 UPLC测定连翘主要有效化学成分含量

2.1.1 UPLC测定连翘主要化学成分指纹图谱

利用连翘标准品对照以及结合文献中连翘主要化学成分指纹图谱分析[13,14,19]，确定了连翘提取物UPLC图谱中的4个主要化学成分色谱峰，并且得到各个化学成分的线性方程。详见图1—2、表2。

2.1.2连翘主要化学成分含量分析

对相同产地、不同炮制方式连翘的主要化学成分含量进行独立样本t检验。与清蒸连翘相比，山西、河南及陕西产地的生晒连翘（+）松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷（β-D-G）、芦丁（RT）、连翘酯苷A(FSA）、连翘苷（PHI）的含量均显著偏低，而仅在山西产地中两种炮制方式连翘的芦丁含量无显著差异。详见图3。

对不同产地、相同炮制方式连翘主要化学成分含量分别进行独立样本t检验。在清蒸连翘中，与其他产地相比，陕西产地的（+）松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、芦丁、连翘酯苷A、连翘苷的含量均显著高于其他产地清蒸连翘中四种化学成分含量值；在生晒连翘中，陕西产地的松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷和芦丁含量最高，山东产地的连翘酯苷A和连翘苷含量最高。详见图4。

2.2连翘抗菌活性MIC值的测定及分析

2.2.1连翘抗菌活性MIC值

与相同产地的生晒连翘相比，相同产地清蒸连翘的最小抑菌浓度MIC值明显偏低，说明清蒸连翘的抑菌作用好于同产地的生晒连翘。详见表3。

2.2.2连翘抗菌活性MIC值与主要化学成分含量值相关性分析

将不同产地、不同炮制方式连翘的抗菌活性MIC值与主要化学成分含量值进行Pearson相关性分析。结果表明，除芦丁外，连翘的（+）松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、连翘酯苷A和连翘苷含量值均与连翘抗菌活性MIC值存在显著的线性负相关，说明连翘药材的抑菌作用与（+）松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、连翘酯苷A和连翘苷等主要有效成分含量存在较好的线性相关：有效成分含量越高，MIC值越低，即连翘抗菌活性越好。详见表4。

3、讨论

实验结果表明，不同产地、不同炮制方式连翘中主要化学成分及抗菌活性均存在差异。生晒连翘的3种化学成分含量值普遍低于相同产地的清蒸连翘；清蒸连翘中，陕西产地连翘中松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、芦丁、连翘酯苷A、连翘苷含量值均高于其他产地连翘中4种化学成分含量；生晒连翘中，陕西连翘的松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷和芦丁含量值最高，山东产地连翘的连翘酯苷A和连翘苷含量值最高。抗菌活性研究结果表明，清蒸连翘的抗菌活性MIC值明显低于相同产地的生晒连翘，表明清蒸连翘的抗菌活性较生晒连翘更好。基于UPLC的主要化学成分研究与抗菌活性研究共同表明，清蒸连翘的药材质量好于生晒连翘，这与马梅芳[20]、王琳[21]等研究结果一致。这是由于采用清蒸处理的连翘具有杀酶保苷[22]的作用，有效成分可以较好的保存下来。而自然晾晒连翘内的酶活性较强，有效成分降解，松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、芦丁、连翘酯苷A、连翘苷这4种有效成分含量均低于清蒸连翘，影响了其质量。综上，基于研究结果，以陕西产地清蒸连翘药材的品质最优。

连翘主要化学成分松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、芦丁、连翘酯苷A、连翘苷等主要化学成分都具有抗菌[23,24]、抗炎[18,25]、抗氧化[26,27]、细胞损伤保护[28,29,30]等作用。本实验证明，连翘煎煮液的抗菌活性与某些化学成分含量存在显著相关性，但是，实验结果中相关性r值较低，这说明连翘煎煮液的抗菌活性可能并不仅仅只与连翘某几种主要有效化学成分含量有关，可能是由于中药植物化学成分复杂，并且经机体代谢后可能会产生多种代谢产物的抗菌成分，所以，一种中药植物的抗菌活性并不是某几种化学成分抗菌效果的单纯叠加，并且连翘的抗菌作用机制也还需要进一步研究。

本研究以连翘药材为例，为不同产地、不同炮制方式中药材的区分及其质量评估提供了研究基础。因此，对药材的道地性质量评价也不应仅仅根据主要化学成分含量值高低，而应结合连翘药材的各种药理作用对药材进行整体评价，从而为中药材质量评价提供更为全面的参考。

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