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生骨补肾胶囊治疗股骨骨折作用及急性毒性试验研究

2023-12-05 116 上传者：管理员

摘要：目的:探讨生骨补肾胶囊治疗股骨骨折作用机制，并通过研究生骨补肾胶囊对小鼠的急性毒性反应，为初步评价其用药安全性。方法:采用闭合骨折法制备股骨骨折模型，观察大鼠体质量、血清炎症因子、股骨骨折处组织愈合及病理变化；采用ICR小鼠经口灌服化瘀止血胶囊，经过14 d的持续观察，了解小鼠中毒的程度和涉及的器官，预测人体过量服用生骨补肾胶囊时可能出现的毒性反应。结果:模型组与正常组比较，大鼠血清中IL-1β和TNF-α均明显或显著升高(P<0.05或P<0.01);给药后，阳性组与模型组比较，大鼠血清中IL-1β和TNF-α均明显或显著降低(P<0.05或P<0.01),生骨补肾胶囊各剂量组水平均降低，高剂量组IL-1β水平和中、高剂量组TNF-α水平降低差异具有统计学意义(P<0.05);CT成像图显示，正常组大鼠左后腿股骨及关节正常，模型组左后腿股骨可见明显骨折及错位现象，各给药组大鼠股骨骨折均不同程度恢复，阳性对照组和生骨补肾胶囊高剂量组大鼠恢复较为明显；HE染色图表明，正常组大鼠股骨、骨髓及肌肉等各级组织生理结构未见明显异常，模型组大鼠可见骨折面毛糙、骨髓丢失、肌肉组织结构紊乱等。给药后，各组大鼠股骨结构部分重建，尤其是补肾胶囊高剂量组大鼠股骨各级生理结构清晰、骨髓和肌肉组织部分恢复，形成骨痂。两组小鼠试验过程中，无明显的自主活动异常、相关毒性反应以及死亡现象；并且与空白对照组相比，在给药当天给药前、给药后第7 d、14 d小鼠体质量无明显区别，并且测得小鼠最大日给药量为16 g/kg。结论:生骨补肾胶囊能有效抑制炎症反应，具有明显的促进股骨骨折愈合作用。小鼠急性毒性试验，表明经口灌服的小鼠与其相关毒性反应、死亡现象无关，此剂量下用药安全且可靠。

关键词：
中成药
急性毒性试验
模型
生骨补肾胶囊
股骨骨折
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生骨胶囊是湘潭市中医医院的院内中成药制剂，由西洋参、丹参、炮山甲、白芷等7味药组成，具有活血祛瘀、行气止痛、益气养阴的功效，临床用于治疗骨质疏松和促进骨折愈合效果显著[1,2,3]。由于受新冠疫情影响，国家出台对野生保护动植物政策，对炮山甲等野生动植物禁止使用。这对大部分医院制剂方中含有炮山甲等野生动植物的受到严重阻碍。基于此，湘潭市中医医院领导、骨科、药学部等专家联合在生骨胶囊原有基础上将炮山甲用牛膝代替，研制开发新的制剂———生骨补肾胶囊，用于治疗各种关节骨折后期，加速愈合。故本研究采用闭合骨折法制备股骨骨折模型，观察大鼠体质量、血清炎症因子、股骨骨折处组织愈合及病理变化；采用小鼠经口急性毒性实验，评价药物的安全性，为临床安全使用和进一步研究开发提供理论依据。

1、材料

1.1 仪器

Multifuge X1R高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；EnVision型多功能酶标仪（PerkinElmer公司）；X线计算机CT断层扫描设备（GE公司）；组织病理检查设备及成像系统（徕卡公司）；CCH-H60生化分析超纯水仪（湖南创纯水处理设备有限公司）；PL3002型电子天平、AB204型电子分析天平，均购自梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.2 试药

生骨补肾胶囊（湘潭市中医医院研制，批号：20210911）；仙灵骨葆胶囊（国药集团同济堂（贵州）制药有限公司，批号：210622）；白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子（TNF-α)ELISA试剂盒（湖南艾方生物科技有限公司，批号：20220215-AF2923、20220215-AF3056）；羧甲基纤维素钠（国药集团化学试剂有限公司，批号：20191203）；异氟烷（瑞沃德生命科技有限公司，批号：21110601),HE染色试剂（湖南艾方生物科技有限公司，批号：AFIHC007）；水为纯化水。

1.3 实验动物

SPF级SD大鼠36只，雄性，体质量180～200g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证号分别为：SCXK（湘）2019-0004。SPF级ICR小鼠40只，雌雄各半，体质量18～20g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证号分别为：SCXK（湘）2019-0004。

2、方法

2.1 小鼠急性毒性试验[4,5,6]

取40只雌雄各半ICR小鼠，体质量18.0～20.0g，根据性别、体质量随机分两组，即对照组和给样组，每组20只。给药前禁食16h以上，临用前采用0.5%CMC-Na溶液配制浓度为0.20g/mL的样品，给样体积为40mL/kg，经口灌胃给样2次，间隔6h，剂量共计为16.0g/kg，对照组灌胃给予同剂量0.5%CMC-Na溶液。在给药后4h内，密切观察各组小鼠活动状况、中毒表现和特点、毒性反应出现及恢复时间以及死亡情况等。如小鼠出现死亡，则进行大体解剖观察，此后存活小鼠连续观察14天。给样当天及给样后第4、7、10、14天对小鼠。观察结束后，处死所有存活小鼠，予以大体解剖肉眼观察，如脏器的发现明显病变，则进行组织病理学解剖检查。

2.2 大鼠股骨骨折模型的影响试验[7,8,9]

36只SD大鼠按体质量随机分为正常组、模型组、阳性组（仙灵骨葆胶囊组）及生骨补肾胶囊低、中、高剂量组，每组6只。适应性饲养5天后，采用闭合骨折法制备股骨骨折模型。具体如下：除正常组外，其余各组大鼠于给药前三天采用骨钳（控制角度）断裂/折断左后腿股骨，观察大鼠腿部的红肿及行动情况，判断模型是否成功后开始给药。造模成功后，阳性组以0.54g/kg剂量灌胃给予阳性组溶液，生骨补肾胶囊低、中、高剂量组分别灌胃给予生骨补肾胶囊溶液0.27g/kg、0.54g/kg、1.08g/kg（其中中剂量为成人临床用量的等效剂量），正常组、模型组给予等量纯化水灌胃，每天1次，连续28天。禁食不禁水过夜（16h），末次给药后1h，大鼠异氟烷麻醉后腹主动脉采血，以3 500r/min离心10min，静置，分离血清。操作严格按照试剂盒说明书检测血清中IL-1β、TNF-α水平含量。末次给药前采用X线计算机断层扫描设备进行成像，CT成像图下，观察大鼠骨折愈合情况。取股骨组织标本（含骨折/裂处和关节），固定于4%多聚甲醛溶液中1天，脱钙21天，石蜡包埋，常规HE染色，镜下观察股骨骨折处组织病理变化。

2.3 统计学分析

采用SPSS 16.0进行统计分析，P<0.05，表明有统计学意义。计量资料采用均数±标准差表示，用Leven's test方法检验正态性和方差齐性，如果符合正态性和方差齐性（P>0.05），用单因素方差分析（ANOVA）和Post Hoc LSD进行统计分析；如果不符合正态性和方差齐性（P<0.05），则用Kruskal-Wallis检验，如果Kruskal-Wallis检验有统计学意义（P<0.05），则用Dunnett's Test（非参数方法）进行比较分析。重复测量资料，满足球对称和齐性时，采用单样本重复测量资料方差分析或成组重复测量资料方差分析，不符合球对称时，要校正F界值；评价时考虑统计学差异和生物学意义。

3、结果

3.1 小鼠一般临床观察

观察给样当天0～4h内及给样后14天，未见给样组小鼠明显异常反应，未见死亡情况。于给样当天及给样后第4、7、10、14天称量体质量，小鼠体质量呈正常增长且体质量增长在正常范围内。具体结果见表1。

表1 小鼠体质量变化

3.2 小鼠大体解剖观察

对所有存活小鼠处死并进行解剖，肉眼观察脏器的位置、大小、色泽、粘连、表面和切面的质地，均未见积液及肿瘤等异常改变。见图1。

3.3 大鼠体质量测定结果

给药前各组大鼠体质量无明显差异，被毛光泽而密，粪便尿液排泌正常；造模组动物左后腿明显肿大，拖行。与正常组比较，给药后模型组动物体质量呈降低趋势；与模型组比较，阳性组动物体质量呈上升趋势；其余各组动物体质量与模型组比较均未见统计学差异；结果见表2、图2。

图1 小鼠大体解剖观察

表2 生骨补肾胶囊对大鼠体质量的影响

图2 各组大鼠体质量的影响

3.4 生骨补肾胶囊对大鼠血清炎症因子的影响

如表3、图3所示，与正常组比较，模型组大鼠血清炎症因子IL-1β和TNF-α均明显或显著升高，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；给药后，与模型组比较，阳性组大鼠血清炎症因子IL-1β和TNF-α均明显或显著降低，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），生骨补肾胶囊各剂量组验证水平均降低，其中高剂量组IL-1β水平和中、高剂量组TNF-α水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）。

表3 生骨补肾胶囊对大鼠血清炎症因子的影响

图3 各组大鼠血清炎性因子含量比较

3.5 生骨补肾胶囊对大鼠股骨骨折组织形态的影响

CT成像结果显示，正常组大鼠左后腿股骨及关节正常，模型组大鼠左后腿股骨可见明显骨折及错位现象，各给药组大鼠股骨的骨折均不同程度恢复，阳性对照组和生骨补肾胶囊高剂量组大鼠恢复较为明显，具体见图4。HE染色结果表明，正常对照组大鼠股骨、骨髓及肌肉等各级组织生理结构未见明显异常，模型组大鼠可见骨折面毛糙、骨髓丢失，肌肉组织结构紊乱等，给药后，各组大鼠股骨结构部分重建，尤其是补肾胶囊高剂量组动物股骨各级生理结构清晰、骨髓和肌肉组织部分恢复，生成骨痂，具体见图5。

4、讨论

在众多骨折类型中，股骨骨折较为常见。据相关临床统计证实，目前股骨骨折的不愈合率约占5%～10%，不仅严重影响患者的生活质量，同时也显著增加患者的经济负担[10]。如何快速促进骨折愈合、缩短治疗时间，是目前亟待解决的问题。生骨补肾胶囊系湘潭市中医医院协定方加工制成，临床治疗骨折效果显著。方中西洋参可以通过增加骨折愈合过程中成骨细胞数量，提高骨胶原纤维合成及提高骨质灰度来促进骨折愈合[11]。丹参含有丹参酮ⅡA，可有效抑制机体血小板聚集、抵抗血栓形成，改善机体血液微循环的作用，加快骨折部位痊愈的速度[12,13,14]。怀牛膝中甾体和皂苷成分可改变骨折的病理状态，从而加快组织修复而促进骨折愈合[15]。血竭中总黄酮成分能阻滞神经传导，干预痛觉信息传递，发挥镇痛作用[16]。

图4 各组大鼠股骨骨折CT成像图结果

图5 各组大鼠股骨骨折病理组织形态（HE×200)

毒性试验是药物研究的中心环节，是评价药物安全的重要指标，通过小鼠灌胃最大给药量的急性毒性实验观察生骨补肾胶囊的用药安全性，证明生骨补肾胶囊制剂的药物安全性高，副作用少。各组大鼠股骨骨折试验数据表明，生骨补肾胶囊对股骨骨折模型大鼠的体质量无明显影响，明显降低其血清中IL-1β和TNF-α炎症因子水平。CT成像图表示，各给药组大鼠股骨的骨折均不同程度恢复，阳性对照组和生骨补肾胶囊高剂量组大鼠恢复较为明显。HE染色结果表明，给药后，各组大鼠股骨结构部分重建，尤其是补肾胶囊高剂量组动物股骨各级生理结构清晰、骨髓和肌肉组织部分恢复，生成骨痂，进一步说明生骨补肾胶囊对骨折愈合和骨痂形成具有一定的促进作用。这填补了生骨补肾胶囊骨折愈合药理活性研究空白，为其他药理活性的研究奠定基础。

参考文献:

[1]张旭桥,王晓晖,黄光明,等.生骨胶囊联合PVP或PKP治疗原发性老年骨质疏松性胸腰椎骨折临床研究[J].中医学报,2018,33(10):2025-2030.

[2]张旭桥,张信成,仇湘中,等.生骨胶囊对骨质疏松大鼠骨组织骨保护素及核因子κB受体活化因子配基表达的影响[J].中国中医骨伤科杂志,2020,28(8):21-25.

[3]张旭桥,王晓晖,黄光明,等.生骨胶囊在经皮椎体强化术治疗老年骨质疏松性胸腰椎骨折中的应用研究[J].中医正骨,2016,28(11):21-25.

[4]柳宇双,杨德森,王叶子,等.参阳胶囊急性毒性及对肾阳虚所致雄性不育大鼠的药效学研究[J].湖北中医药大学学报,2020,22(5):5-9.

[5]刘玉明,蒋定文,李珂娴,等.银参胶囊的急性毒性和长期毒性实验考察[J].中国药师,2020,23(7):14 57-1461.

[6]罗纯清,王兴,罗黎霞,等.医院制剂银黄解毒消肿胶囊急性毒性试验[J].亚太传统医药,2020,16(12):17-19.

[7]郇义超,赵佳,魏迎亮.益气健骨补肾法对股骨骨折模型大鼠的作用及机制研究[J].中医学报,2021,36(11):2381-2387.

[8]刘明,刘杨,张永萍,等.新仙灵骨葆胶囊对大鼠骨折愈合的影响研究[J].中国药房,2018,29(9):1201-1204.

[9]王希强,孙仁光,孙仕润,等.丹参接骨胶囊对闭合性股骨骨折模型大鼠骨折愈合的影响[J].中国组织工程研究,2016,20(5):622-627.

[10]张开.股骨骨折不愈合的临床原因分析及对策探讨[J].临床医药文献电子杂志,2017,4(57):11121-11122,11124.

[11]张生.西洋参对骨折愈合影响的实验研究[D].福州:福建中医学院,2004.