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HPLC同时测定杜仲-川芎药对中的7种成分

2023-12-19 94 上传者：管理员

摘要：目的采用HPLC法同时测定杜仲-川芎药对中绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A、藁本内酯等7种成分的含量。方法采用Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5μm),流动相为乙腈-0.1%磷酸水，检测波长326 nm(绿原酸、阿魏酸、藁本内酯)、276 nm(松脂醇二葡萄糖苷、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A),进样量10μL。结果绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A、藁本内酯的线性范围分别为5.160～258.0、6.624～331.2、3.490～174.5、1.522～76.10、0.3212～16.06、25.44～1.277×103、21.98～1.099×103μg·mL-1(r>0.999);平均加样回收率为96.73%～103.09%,RSD为0.68%～2.6%(n=6)。结论所用方法高效、便捷、准确、稳定，可为杜仲-川芎药对的质量控制提供参考。

关键词：
化学成分
川芎
杜仲
波长切换
药对
高效液相色谱法
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杜仲-川芎药对源自《备急千金要方》中的独活寄生汤，其中，杜仲长于补肝肾、强筋骨，为常用的补肾药；川芎以活血行气、祛风止痛见长，为常用的活血药；两者配伍使用，具有补肾强骨、活血通络的作用，临床上常随证加减用于治疗骨关节炎[1]。川芎中的阿魏酸能通过抑制炎症介质释放，降低肿瘤坏死因子α、白细胞介素-6、一氧化氮等的含量，发挥治疗骨关节炎的作用；洋川芎内酯A和藁本内酯可通过不同靶点阻碍炎症的信号传递，影响下游蛋白，从而发挥抗炎作用[2]。杜仲中的松脂醇二葡萄糖苷可通过调节PI3K/AKT通路保护软骨[3];绿原酸可抑制炎症因子介导的MMP-3活化，起到一定的软骨保护作用。尚未见杜仲-川芎药对多成分含量测定的研究报道，现采用HPLC法同时测定杜仲-川芎药对中绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A、藁本内酯等7种成分的含量，为杜仲-川芎药对的质量控制和临床应用提供参考。

1、实验部分

1.1 仪器与试药

e2695型高效液相色谱仪(美国Waters)。绿原酸(>96%)、阿魏酸(>98%)对照品(中国食品药品检验研究院，批号分别为：110753-202018、110773-201915);松脂醇二葡萄糖苷(>98%)、洋川芎内酯I(>98%)、洋川芎内酯H(>98%)、洋川芎内酯A(>98%)、藁本内酯(>98%)对照品(成都克洛玛生物科技有限公司);杜仲饮片、川芎饮片(浙江天道医药有限公司各两批，批号分别为201002、210201和200601、210401;安国润德药业有限公司各一批，批号分别为C200817607、C200929612),经鉴定分别为杜仲科杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的树皮、伞形科川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的根茎，均符合2020年版《中国药典》一部项下的规定；甲醇、乙腈为色谱纯；水为超纯水；其余试剂为分析纯。

1.2 方法与结果

1.2.1 溶液的制备

分别精密称取绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A、藁本内酯等对照品适量，加甲醇制成2.048、0.900、2.102、3.624、1.784、5.578、8.792 mg·mL-1的对照品贮备液。分别精密吸取上述7种贮备液适量，置10 mL量瓶中，用甲醇定容，得86.02、110.7、69.37、36.24、7.136、641.5、439.6 μg·mL-1的混合对照品溶液。取杜仲(过10目筛)、川芎(过40目筛)饮片粉末，各约0.4 g, 精密称定，加入75%乙醇10 mL,称定，浸泡30 min, 于90 ℃水浴回流30 min, 冷却至室温，称量，用溶剂补足减失的重量，过滤，取续滤液于4 ℃、1.2×104 r·min-1冷冻离心15 min, 取上清液，即得供试品溶液。分别取杜仲(10目)、川芎(40目)饮片粉末各约0.4 g, 精密称定，按上述供试品溶液制备方法分别制得杜仲、川芎对照药材溶液。

1.2.2 色谱条件

采用Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm),流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脱(0～15 min、10%→16%A,15～19 min、16%→20%A,19～34 min、20%→30%A,34～39 min、30%→50%A,39～49 min、50%→75%A,49～60 min、75%→90%A),流速1.0 mL·min-1,检测波长326 nm(绿原酸0～11 min、阿魏酸18～25 min、藁本内酯47～60 min)、276 nm(松脂醇二葡萄糖苷11～18 min; 洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A,25～47 min),柱温为25 ℃,进样量为10 μL。

1.2.3 专属性的试验

取混合对照品、杜仲-川芎药对供试品及杜仲、川芎对照药材溶液，分别在“1.2.2”项的色谱条件下进样，记录色谱图(图1)。杜仲-川芎药对供试品溶液在对照品相应位置上，均有相同保留时间的色谱峰；杜仲对照溶液中不含阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A、藁本内酯的峰，川芎对照溶液中不含松脂醇二葡萄糖苷的峰；绿原酸为杜仲、川芎的共有成分。表明方法的专属性良好。

图1 混合对照品(A)、供试品(B)、川芎对照药材(C)和杜仲对照药材(D)溶液的色谱图

1.2.4 线性关系的考察

分别精密吸取各对照品贮备液适量至同一1 mL量瓶中，加甲醇定容，得绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A、藁本内酯的浓度分别为258.0、331.2、174.5、76.10、16.06、1.277×103、1.099×103 μg·mL-1的混合对照品溶液。加甲醇逐级稀释至2、5、10、20、50倍后，分别在“1.2.2”项色谱条件下进样，以各待测成分的浓度(μg·mL-1)为横坐标、相应峰面积为纵坐标进行线性回归，得到7个成分的回归方程，各待测成分在相应浓度范围内与峰面积均有良好的线性关系(表1)。

表1 7种成分线性关系的考察结果

1.2.5 精密度、稳定性与重复性的试验

精密吸取混合对照品溶液，连续进样6次，记录峰面积。计算得绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A、藁本内酯峰面积的RSD分别为0.94%、0.79%、1.00%、0.69%、1.10%、1.50%、1.50%,表明仪器的精密度良好。取供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、12、24、48 h后进样，记录峰面积。计算得到7种成分峰面积的RSD分别为1.20%、1.90%、1.50%、2.70%、2.50%、1.80%、0.99%,表明供试品溶液在48 h内稳定。取同一批杜仲(210201)、川芎(210401)饮片粉末各约0.4 g, 平行6份，精密称定，制备供试品溶液，分别进样测定，记录峰面积。计算得7种成分的平均含量分别为2.145、2.759、1.741、0.9417、0.1921、15.98、11.40 mg·g-1,含量的RSD分别为2.50%、0.83%、1.80%、1.90%、2.00%、1.10%、1.60%,表明方法的重复性良好。

1.2.6 样品的含量测定

取3个批次的杜仲、川芎饮片，按“1.2.1”项方法制备供试品溶液，在“1.2.2”项色谱条件下分别进样测定，结果见表2。采用SPSS 26.0统计软件分析，发现配伍后，药对中松脂醇二葡萄糖苷的含量增加，洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A及藁本内酯的含量无明显变化，而绿原酸、阿魏酸的含量减少。

表2 样品的含量测定结果(mg·g-1,n=3)

1.2.7 加样回收率的试验

取同一批已测含量的杜仲(210201)、川芎(210401)饮片粉末各约0.2 g, 平行制备6份，精密称定，分别精密加入各对照品贮备液，按“1.2.1”项方法制备供试品溶液，在“1.2.2”项色谱条件下分别进样测定，计算加样回收率及RSD(表3)。

表3 加样回收率的试验结果(mg, n=6)

2、讨论

根据文献报道对杜仲-川芎中可能含有的活性成分进行了预实验，未见川芎中川芎嗪及杜仲中槲皮素的色谱峰，桃叶珊瑚苷及咖啡酸的色谱峰非常小。主要是因为槲皮素和咖啡酸的含量较低，桃叶珊瑚苷只有较弱的末端吸收[4,5,6];而川芎嗪是川芎中独有的挥发性生物碱，生物活性强，但因其极不稳定，光照、加热或长期储存均会使其分解，因此在多批次川芎中均未检出。松脂醇二葡萄糖苷为2020年版《中国药典》中杜仲的指标成分；阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A和藁本内酯为川芎的主要功效成分；绿原酸为两者共有成分，具有一定的抗炎作用。故选择上述7种成分作为杜仲-川芎药对的质量控制指标。曾分别考察了不同提取方法(回流、超声)、提取溶剂(25%、50%、75%乙醇或甲醇)、提取时间(30、45、60 min)、溶剂倍量(25、50、100、150倍)和浸泡时间(0.5、1、2 h)对样品中各成分含量的影响，最终确定文中供试品溶液的制备方法。采用二极管阵列检测器对各成分进行全波长扫描，确定绿原酸、阿魏酸、藁本内酯的最大吸收波长为326 nm, 松脂醇二葡萄糖苷、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H和洋川芎内酯A的最大吸收波长为276 nm, 为使各成分均能在最大吸收波长下被同时测定，故采用波长切换技术。曾考察了不同流动相体系(甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液)的洗脱效果，结果以乙腈-0.1%磷酸水最优。对杜仲-川芎药对配伍前后各成分进行了检测，发现配伍后松脂醇二葡萄糖苷的含量增加，推测可能是川芎促进了杜仲中松脂醇二葡萄糖苷的溶出；配伍后洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A及藁本内酯的含量无明显变化，说明杜仲对川芎中内酯类成分的溶出无影响；配伍后阿魏酸、绿原酸的含量减少，推测其可与川芎中生物碱类成分结合。多批次杜仲-川芎饮片中7个成分的含量测定结果显示：不同批次各待测成分的含量差异较大，可能与药材的产地、贮藏条件因素相关[7]。相较于新鲜饮片，贮藏时间较久的饮片中，洋川芎内酯A和藁本内酯的含量明显减少，可能是由于川芎挥发油中内酯类成分极不稳定，易转化为其他物质。文中采用HPLC法同时测定了杜仲-川芎药对中7个成分的含量，该方法高效、便捷、准确、稳定，可为杜仲-川芎药对的质量控制提供一定的参考。

参考文献:

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[4]张凌风,洪雅丹,骆媱,等.HPLC法测定杜仲-淫羊藿药对中8个化学成分的含量[J].药物分析杂志,2019,39(5):772-779.

[5]梁桂洪,曾令烽,潘建科,等.川芎嗪干预骨性关节炎的机制研究进展[J].中华中医药杂志,2020,35(12):6228-6232.

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[7]王娟娟,秦雪梅,高晓霞,等.杜仲化学成分､药理活性和质量控制现状研究进展[J].中草药,2017,48(15):3228-3237.

基金资助:国家自然科学基金资助项目(批准号:81874340);

文章来源:裘佳韦,王娅红,章建华等.HPLC同时测定杜仲-川芎药对中的7种成分[J].华西药学杂志,2023,38(06):695-699.