禾本科植物甘蔗Saccharum sinensis Roxb.Saccharum officinarum Linn.的叶为广西民间及瑶族用药，药用历史悠久，收载于《广西瑶药材质量标准》第二册。早期瑶族传承主要依赖口口相传，缺乏甘蔗叶的文字记载。经调研整理，其瑶医用途主要有：甘蔗叶茶治疗盗汗、甘蔗叶水煎液治疗消渴症以及甘蔗叶煎水洗浴治疗汗证。甘蔗叶作为甘蔗生产的废弃物，仅有25%作为饲料使用，大部分废弃，资源浪费的同时也造成环境污染。采用不同提取方法可从甘蔗叶中得到具有生物活性的多糖分子，当前对于甘蔗叶多糖提取的研究主要集中于热水提取法及酶解工艺，存在多糖含量低、提取率不高的问题[1,2]。采用碱液制备甘蔗叶或甘蔗渣多糖的研究主要针对木聚糖的前期提取[3,4]。课题组前期研究发现：甘蔗叶粗多糖是瑶医中甘蔗叶的主要降糖活性成分。甘蔗叶多糖可降低链脲佐菌素致糖尿病大鼠的血糖，预防非肥胖型糖尿病小鼠糖尿病，改善心肌梗死大鼠的心功能，减轻大鼠心肌梗死后梗死周边区心肌间质纤维化等[5,6,7,8]。现采用碱性预处理高温提取的方法，分别考察各反应条件对甘蔗叶多糖含量的影响，再在单因素实验的基础上，以多糖含量为考察指标，采用正交试验筛选最优提取工艺。通过柱前衍生化HPLC法分析其单糖组成，高效凝胶色谱法检测其分子量。并建立高糖心肌细胞H9c2炎症损伤模型，初步研究甘蔗叶多糖对高糖损伤心肌细胞的药效，为甘蔗叶的开发和质量标准的建立提供依据。

1、实验部分

1.1 仪器、试药与动物

2690型高效液相色谱仪(美国Waters);En-VisionXcite高通量酶标仪(美国PerkinElmer);UV 1800紫外分光光度计(日本岛津)。无水葡萄糖(Glc)及右旋糖酐系列对照品D1、D2、D3、D4、D5、D6(分子量分别为5.9、9.6、21.1、47.1、107.0、220.729 kD)(中国食品药品检定研究院，批号分别为：110833-201908、140638-201203、140639-201203、140640-201203、140641-201203、140642-201203、140643-201203);D-无水葡萄糖(美国Sigma);甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)等单糖对照品(北京索莱宝科技有限公司);甘蔗叶药材(采自广西南宁市武鸣跃进村，经广西中医药大学韦松基教授鉴定为禾木科甘蔗Saccharum sinensis Roxb.Saccharum officinarum Linn.的叶，采摘后阳光下自然晾晒至干燥后避光保存，使用时切成约4～5 cm小段);其余试剂为分析纯。H9c2(2-1)大鼠心肌细胞系(中国科学院上海细胞库)。

1.2 甘蔗叶多糖提取工艺的优化

1.2.1 多糖标准曲线的绘制及含量测定

分别精密量取0.1 mg·mL-1葡萄糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL,置具塞试管中，各加水补至1.0 mL后，分别加入1.0 mL 5%苯酚溶液和3 mL硫酸，振荡混合后，置水浴锅中沸水加热10 min, 冷却至室温后，用空白试剂作为参比溶液，紫外分光光度计在485 nm处测定吸光度。以葡萄糖溶液的浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线方程为：Y=10.572X-0.0369(r2=0.9973)。取样品定容至10 mL量瓶中，取1 mL上述样品溶液，分别加入1.0 mL 5%苯酚溶液和3 mL硫酸，振荡混合后，置水浴锅中，沸水加热10 min, 冷却至室温后，用空白试剂作为参比溶液，紫外分光光度计在485 nm处测定吸光度，带入上述标准曲线可计算样品中多糖的浓度，再按以下公式计算样品中甘蔗叶多糖的含量。甘蔗叶多糖=C×V×D/W×100%。式中，C为多糖溶液的浓度(mg·mL-1);V为多糖溶液的体积(mL);W为配制原液所需甘蔗叶多糖的质量(mg);D为稀释倍数。

1.2.2 单因素实验

将甘蔗叶与3 mol·L-1 NaOH和3 mol·L-1 H2O2的碱性溶液与按25:1的比例在室温下预处理30 min后过滤，再加入30倍水，用150 ℃高温反应釜提取(30 min×3),将提取液合并浓缩后，加80%乙醇静置，取沉淀，透析得到的甘蔗叶多糖。固定其他的条件不变，分别考察预处理时间(15、30、45、60、120 min)、提取时间(15、30、45、60、90 min)、提取温度(140、150、160、180、200 ℃)、提取次数(1、2、3、4、5)、碱液浓度(1 mol·L-1 NaOH+1 mol·L-1 H2O2、2 mol·L-1 NaOH+2 mol·L-1 H2O2、3 mol·L-1 NaOH+3 mol·L-1 H2O2、4 mol·L-1 NaOH+4 mol·L-1 H2O2、6 mol·L-1 NaOH+6 mol·L-1 H2O2)对甘蔗叶多糖含量的影响。由图1A可知：碱液预处理15～45 min时，多糖含量随提取时间的增加而增加，在45 min时最高；45～60 min后含量开始下降；在60～120 min时，多糖的含量又呈上升趋势，但较45 min前趋势更缓。可能是随着提取时间的增加，木质素的降解率增大，能一定程度提高多糖的提取；但同时碱液对样品细胞壁结构和化学成分发生影响，一定的多糖被分解后溶于水。综合考虑，选择碱液预处理15～60 min进行正交试验。由图1B可知：高温提取60 min时，多糖的含量最高。因此，选择提取15～60 min进行正交试验。由图1C可知：多糖含量随提取温度的升高呈先上升后下降的趋势，180 ℃时含量最高；但随着温度过高，降低多糖结构表面的张力，增加表面微气泡的蒸气压，反而降低了多糖的溶出，故在200 ℃时多糖的提取率反而下降。因此，选择140～180 ℃进行正交试验。由图1D可知：提取2次时，多糖的含量最高；当超过2次时，大部分多糖已被提取，增加提取次数可能会使其他水溶性杂质大量溶出，浓缩药液进行醇沉时会增加浓缩时间，同时可能导致多糖结构的破坏，从而导致含量下降。考虑成本与效率，选择提取1～4次进行正交试验。由图1E可知：多糖的含量随碱液浓度出现先增加后减少的趋势，过高浓度的碱液会发生碱催化下的多糖水解，使多糖的含量下降，在两种碱液浓度均为3 mol·L-1时，多糖的含量最高。最终选择碱液浓度为1～4 mol·L-1进行正交试验。

图1 碱液预处理时间(A)、提取时间(B)、提取温度(C)、提取次数(D)、碱液浓度(E)的单因素试验结果   

1.2.3 正交试验

在单因素实验的基础上，以预处理时间(A)、提取温度(B)、提取时间(C)、提取次数(D)、碱液浓度(E)为变量，多糖含量为考察指标，各因素设计4个水平(表1),采用正交试验优化甘蔗叶多糖的提取工艺。由表2可知：5个因素的极差大小分别为E>B>D>C>A,表明5个因素对甘蔗叶多糖含量的影响分别为：碱液浓度>提取时间>提取次数>提取温度>预处理时间。由表3可知：碱液浓度对提取的影响有显著性差异，最优提取工艺为A2B2C3D2E3。结合单因素实验的结果，确定最佳提取工艺为：碱液(3 mol·L-1 NaOH+3 mol·L-1 H2O2)预处理30 min, 160 ℃高温提取30 min, 提取2次。按上述最佳提取工艺平行制备3批甘蔗叶多糖，按“1.2.1”项方法测定含量。3批甘蔗叶多糖的含量分别为75.60%、76.13%、77.42%,平均76.38%,RSD=1.23%。

1.3 甘蔗叶多糖的单糖组成分析

1.3.1 溶液的制备

称取按“1.2.3”项最佳工艺制备的甘蔗叶多糖50 mg, 加入2 mol·L-1三氟乙酸10 mL,封口，摇匀，于1010 ℃下水解6 h, 冷却至室温，于1×103 r·min-1离心5 min 后，取上清液，NaOH中和至中性，水浴蒸干，加60%乙腈溶解，定容至5 mL,得约10 mg·mL-1的水解液。取500 μL上述水解液置干燥试管中，依次加入0.5 mol·L-1 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)的甲醇溶液0.3 mol·L-1 NaOH溶液各500 μL,混匀，于70 ℃水浴加热反应30 min, 取出于室温下放置10 min, 再加入0.3 mol·L-1盐酸500 μL中和，加水1 mL,用氯仿萃取(1 mL×3),弃氯仿层，水层于3×103 r·min-1离心3 min, 用0.45 μm微孔膜过滤，得供试品溶液。取甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、无水葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖等单糖对照品，置同一50 mL量瓶中，按上述供试品溶液制备方法衍生化处理后，得单糖混合对照品溶液。

表1 碱性预处理高温法正交试验的因素水平表

表2 正交试验的设计与结果 导

表3 方差分析表

1.3.2 色谱条件

采用Ultimate XB-C18色谱柱，流动相为磷酸盐缓冲液(pH6.8)-乙腈(16.5:83.5),洗脱时间75 min, 检测波长250 nm, 进样量10 μL,柱温为室温。

1.3.3 线性关系的考察

精密量取“1.3.1”项下单糖混合对照品溶液适量，用水稀释1、2、4、8、16、32倍后，按“1.3.2”项色谱条件进样，记录色谱图。以单糖浓度和峰面积作为横、纵坐标，进行线性回归。8种成分的单糖在相应浓度范围内与峰面积的线性关系良好(表4)。

1.3.4 精密度、稳定性与重复性的试验

取单糖混合对照品溶液适量，按“1.3.2”项色谱条件，连续进样6次，计算得甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、无水葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖峰面积的RSD分别为0.31%、0.32%、0.69%、0.77%、0.36%、0.53%、0.35%、0.41%(n=6),表明仪器的精密度良好。取甘蔗叶多糖样品，按“1.3.1”项方法制备供试品溶液，分别在0、3、6、9、12 h时进样测定，计算得8种单糖成分峰面积的RSD分别为0.87%、0.48%、1.46%、1.02%、1.39%、3.46%、0.57%、0.71%(n=6),表明溶液在12 h内稳定。取同一批样品共6份，平行制备供试品溶液，按“1.3.2”项色谱条件进样测定，计算得8种单糖成分含量的RSD分别为2.94%、1.47%、3.61%、2.81%、0.75%、1.91%、0.58%、0.54%(n=6),表明方法稳定有效。

表4 8种成分的回归方程、线性范围和相关系数(n=6)

1.3.5 回收率的试验

取25 mg甘蔗叶多糖样品，共6份，按“1.3.1”项方法水解并衍生化处理后，加入含量相同的单糖对照品，按“1.3.2”项色谱条件进样测定，计算回收率及RSD(表5)。

1.3.6 甘蔗叶多糖中的单糖组成

取“1.3.1”项下单糖混合对照品溶液和甘蔗叶多糖供试品溶液，按“1.3.2”项色谱条件分别进样，记录色谱图。由图2可知：甘蔗叶多糖主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、无水葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖组成，代入标准曲线中计算得8种单糖的含量分别为3.86、9.02、4.13、8.92、32.01、56.96、614.89、278.31 mg·g-1。在前期甘蔗叶多糖研究中也发现：其单糖组成较为复杂，主要含有无水葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖和少量葡萄糖醛酸、甘露糖和鼠李糖，其色谱峰的响应值很低(约20 mAu),与文中结果基本相符[4]。

表5 加样回收率的试验结果(mg·mL-1,n=6)

图2 单糖混合对照品(A)和供试品(B)溶液的HPLC色谱图   

1.4 甘蔗叶多糖分子量的检测

1.4.1 溶液的制备

取干燥至恒重的右旋糖酐系列对照品D1、D2、D3、D4、D5、D6,精密称定，加纯水溶解至10 mg·mL-1,0.22 μm滤膜过滤，作为对照品溶液。称取10.6 mg甘蔗叶多糖粉末，加流动相制成约5.3 mg·mL-1的溶液，振荡混匀，0.22 μm滤膜过滤，作为供试品溶液。

1.4.2 色谱条件

采用TSK gel4000GMPWx检测多糖专用凝胶色谱柱，柱温25 ℃,流动相为纯水，流速0.8 mL·min-1,示差检测器温度为40 ℃。

1.4.3 精密度、重复性及稳定性的试验

取右旋糖酐D3对照品溶液，连续进样6次，计算得相对保留时间的RSD=0.07%,表明仪器的精密度良好。取6份同一批甘蔗叶多糖供试品溶液进样测定，计算得相对保留时间的RSD=0.19%,表明方法的重复性良好。取同一份甘蔗叶多糖，按“1.4.1”项方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h时进样测定，计算得相对保留时间的RSD=0.40%,表明方法的稳定性良好。

1.4.4 分子量的测定

右旋糖酐系列对照品的保留时间(t)与其分子量(Mw)的对数呈显著负相关性，回归方程为：Y=-2.2154X+20.568(r2=0.9974)。如表6、图3所示：甘蔗叶多糖的相对保留时间为10.55 min。代入回归方程中计算，得到其分子量为33.113 kD 。

表6 右旋糖酐分子量校正曲线数据及样品的测定结果

图3 纯水和甘蔗叶多糖的凝胶色谱图   

1.5 甘蔗叶多糖对心肌细胞损伤的保护作用

1.5.1 高糖对心肌细胞增殖的抑制

取对数生长期的H9c2细胞，按每毫升5×106个细胞接种于96孔板中，每孔100 μL,继续培养至贴壁24 h后，将细胞分成对照组(25 mmol·L-1)和高糖组(50、100、150 mmol·L-1),每组设3个复孔，加入相应浓度的D-葡萄糖溶液处理48 h后，加入100 μL含10% MTS试剂的DMEM完全培养基(25 mmol·L-1),于5% CO2恒温培养箱中孵育2 h。使用高通量酶标仪，在490 nm处测定各组的吸光值，观察高糖对心肌细胞活力的影响。由图4可知：随着葡萄糖浓度的增加，H9c2心肌细胞的活力逐渐降低。与对照组比较，50 mmol·L-1葡萄糖干预48 h后对心肌细胞有一定的影响(P<0.05),100、150 mmol·L-1葡萄糖组细胞的活力极显著下降(P<0.01),提示葡萄糖抑制H9c2细胞增殖的作用随糖浓度的增大而增强。

图4 不同浓度D-葡萄糖对H9c2心肌细胞活力的影响(n=3)   

1.5.2 甘蔗叶多糖对心肌细胞损伤的保护作用

取对数生长期的H9c2细胞平铺于96孔板中，按每毫升5×106个细胞接种于96孔板中，每孔100 μL,继续培养至贴壁24 h后，将细胞分为空白组、模型组(100 mmol·L-1葡萄糖)和试验组(7.5、15、30、60、120、240、500、1×103 mg·L-1甘蔗叶多糖)组，每组设3个复孔，分别用相应浓度的糖溶液处理各组细胞，干预48 h, 空白组不做任何处理。加入含10% MTS的DMEM完全培养基，避光于37 ℃孵育2 h, 置高通量酶标仪筛选系统中，于490 nm处测定吸光度，计算细胞活力的变化率，实验重复3次。细胞活力变化率=(OD试验- OD空白)/(OD对照-OD空白)×100%。由图5可知：与模型组比较，甘蔗叶多糖干预48 h后，对高糖损伤的H9c2心肌细胞具有一定的保护作用，细胞活力随浓度增加呈上升的趋势，且60 mg·mL-1甘蔗叶多糖组开始有显著性差异(P<0.05),1.0 mg·mL-1甘蔗叶多糖组有极显著差异(P<0.01),说明甘蔗叶多糖对高糖损伤的心肌细胞活力具有保护作用。

图5 甘蔗叶多糖对高糖诱导的H9c2细胞活力的影响   

1.5.3 数据的分析

所得数据以表示，采用GraphPad 8.0软件分析，使用t检验比较两组间数据，多组间数据比较采用单因素方差分析，P<0.05时有统计学意义。

2、讨论

高温热水提取甘蔗叶多糖时不需要添加化学试剂，且处理后液相中的抑制物含量较低。其机制为水在高温高压下电离出H+作用于半纤维素的乙酰基上，半纤维素的乙酰基团在高温高压的酸性环境不稳定易脱落生成乙酸，乙酸电离产生的H+继续作用于半纤维素的糖苷键，使之断裂形成低聚糖和单糖[9]。因此，在合适的温度和时间内可有效地提高多糖的提取效率。当温度高于180 ℃时，甘蔗叶多糖虽然含量变高，但其得率及成品出现碳化的现象，故选择小于180 ℃进行后续实验。对甘蔗叶多糖的单糖组成和分子量进行分析发现：甘蔗叶多糖是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、无水葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖组成的，其中，木糖为主要成分。多糖的生物活性可能与其结构特征有关，木糖具有一定的降糖活性，且对α-葡萄糖苷酶表现出一定的抑制活性，可能具有降血糖的作用[9]。文中建立了高糖损伤的H9c2细胞模型，采用不同浓度的甘蔗叶多糖进行干预治疗，结果甘蔗叶多糖可抑制高糖H9c2细胞的损伤。文中结果为对甘蔗叶的开发利用提供了依据。

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基金资助:国家自然科学基金资助项目(批准号:82060762);广西科技重大专项(2022AA01016);农作物废弃物功能成分研究协同创新中心(2022-03);广西中药药效研究重点实验室运行补助项目(20-065-38);广西研究生教育创新计划资助项目(YCXJ2021015);

文章来源:王星圆,张帆,黄建朝等.甘蔗叶多糖提取工艺的优化及其心肌细胞保护作用的研究[J].华西药学杂志,2023,38(06):621-627.