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肉苁蓉总苷对脑缺血再灌注大鼠氧化应激损伤及细胞凋亡的影响

2023-12-20 67 上传者：管理员

摘要：目的:探讨肉苁蓉总苷(GCs)对脑缺血再灌注损伤(CIRI)大鼠氧化应激损伤及神经细胞凋亡的影响及可能机制。方法:模型大鼠采用线栓法构建大脑中动脉闭塞(MCAO)模型。造模成功后，药物组(GCs)大鼠给与GCs 50 mg/(kg·d)灌胃，连续14 d;假手术组(Sham)及模型组(Model)大鼠给与同等体积生理盐水灌胃。给药结束后采用Longa评分法评价其神经功能缺损情况；随后处死大鼠，进行TTC染色计算脑梗死面积百分比；ELISA法检测血清丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性；蛋白免疫印记(Western blot)检测脑组织中核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶-1(HO-1)以及B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表达情况。结果:与Sham组相比，Model组神经功能缺损评分升高，脑梗死面积百分比升高，MDA含量升高，SOD和GSH-Px活性降低，Nrf 2、HO-1及Bcl-2蛋白表达水平下降，Bax及Caspase-3蛋白表达水平升高；与Model组相比，GCs组大鼠神经功能缺损评分有所降低，脑梗死面积百分比降低，MDA含量降低，SOD和GSH-Px活性升高，Nrf 2、HO-1及Bcl-2蛋白表达水平升高，Bax及Caspase-3蛋白表达水平下降。结论:GCs可有效地减轻脑缺血再灌注损伤，其机制可能与激活Nrf 2/HO-1通路，进而降低氧化应激水平，抑制神经细胞的凋亡有关。

关键词：
氧化应激
细胞凋亡
缺血性脑卒中
肉苁蓉总苷
脑缺血再灌注损伤
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缺血性脑卒中（cerebral ischemia-reperfusion,CIS）是一类发病率、致残率及致死率均极高的疾病。脑细胞对于缺血缺氧极度敏感，所以尽快实现脑血管再通是应对急性缺血性脑卒中最有效的办法。静脉溶栓和机械取栓是目前沿用较广的手段，但由于其较窄的时间窗以及其他不可控因素的限制，仅有<10%的卒中患者可以在有效时间内实现血管再通。脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI）是一类脑血管从狭窄到恢复血流的过程中出现的一种叠加的病理损伤。目前认为其病理机制可能与兴奋性氨基酸毒性、钙超载、炎性因子释放、线粒体损伤致氧自由基蓄积有关[1]，最终造成血脑屏障破坏、微循环障碍、神经细胞凋亡和坏死[2]等一系列反应，从而进一步加重神经功能缺损。

肉苁蓉总苷（glycosides of cistanche,GCs）是从中药肉苁蓉（Herba Cistanches）茎、根中提取出的主要有效成分。前期的研究显示，GCs可有效抑制脂质过氧化、改善线粒体功能、清除过量的氧自由基、抑制炎性细胞因子释放、降低细胞毒性、抗血小板聚集、抑制细胞增殖、抑制神经元凋亡以及调节激素水平，从而具有抗衰老、抗肿瘤、抗抑郁、增强免疫力、改善缺血性心脑血管疾病、改善学习记忆能力及认知功能、改善生殖等作用[3]。已有研究表明，GCs可以减轻细胞的氧化损伤，维护血脑屏障的完整性[4];GCs能有效提高细胞活力，阻断缺血再灌注发生后诱导的炎症和凋亡[5];Nrf 2在抗炎及抗氧化的过程中发挥着重要作用[6]。基于以上背景，本文旨在通过复制CIRI模型，进一步研究GCs对CIRI后氧化应激及细胞凋亡的影响以及可能通路。

1、材料与方法

1.1 药物及试剂

GCs(SN-5692，纯度98%，西安神农生物公司），2%氯化三苯基四氮唑（TTC）染液（北京索莱宝科技有限公司），ELISA试剂盒（北京博奥森公司），BCA蛋白定量分析试剂盒（美国Cell Signaling Technology公司），兔抗鼠抗体Bcl-2、Bax、Caspase-3、Nrf 2,HO-1、山羊抗兔二抗等抗体均购自美国Proteintech公司。

1.2 仪器

离心机（型号：TDL-40B，上海安亨科学仪器厂），酶标仪（型号：Max-M5，美国Molecular Devices公司），SDS-PAGE电泳仪（型号：DYY-7C，北京六一生物科技有限公司），凝胶扫描仪（型号：4466611，美国BIO-RAD公司）。

1.3 动物

雄性Wistar大鼠[SCXK（京）2019-0010]，清洁级，8周龄，体质量250～280 g。

1.3 方法

1.3.1 分组及造模

大鼠采用简单随机化分组法分为假手术组（Sham）、模型组（Model）、药物组（GCs），每组15只，适应性饲养1周后造模。术前12 h严格禁食水，Model组与GCs组采用线栓法[7]制作大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）大鼠模型，缺血2 h后拔栓实现复灌，记录再灌注开始时间。缝合创口，碘伏消毒皮肤后回笼饲养，再灌注24 h。Sham组大鼠操作同模型大鼠，但不进行插栓处理。每组最终保留10只大鼠进行后续实验。

1.3.2 给药方式

取GCs粉末，加纯水配置成15 mg/mL的药液。前期研究显示50 mg/（kg·d）的剂量优于其它剂量组[8]，故本次实验选用的给药剂量同前。GCs组大鼠于缺血再灌注24 h后给与GCs灌胃，Sham组及Model组给与同等体积的生理盐水灌胃，连续给药14 d。

1.3.3 神经功能缺损评分

采用Longa评分法[7]，分别于术后24 h后评分，保留1～3分模型大鼠进行后续实验。末次给药结束后进行评分。0分：无神经病学症象；1分：轻微神经功能缺损，提尾悬空时病灶对侧前肢屈曲，抬高，肩内收；2分：中度神经功能缺损，提尾悬空时对侧前肢屈曲，抬高，肩内收，行走时向病灶对侧转圈；3分：重度神经功能缺损，行走时向病灶对侧倾倒；4分：无意识及自主活动。

1.3.4脑梗死面积百分比测定

于末次给药结束后，每组随机取4只大鼠，深度麻醉，断头取脑后迅速将脑组织置于-20℃冰箱速冻20 min，待脑组织相对固定后取出，从脑前极到视交叉连线的交点处开始，从额到枕部，将大鼠脑沿冠状位切成5个厚度为2 mm的脑片，浸于2%TTC溶液中，置于37℃水浴锅中染色15 min后翻面，再染15 min。最后将脑片浸于4%多聚甲醛溶液中固定12 h后拍照，正常脑组织显示为红色，梗死脑组织显示为白色。用images软件分析，计算各脑片的梗死率，梗死率=梗死面积/脑片总面积×100%。

1.3.5 氧化应激相关指标检测

麻醉大鼠，取腹主动脉血4 mL，分装于干净EP管后放入4℃冰箱中静置0.5 h,4℃3 500 r/min离心15 min，取上清，每组最终保留3只大鼠的血清。按照ELISA试剂盒操作方法测定丙二醛（malondialdehyde,MDA）的含量以及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）的活性。

1.3.6 Western blot检测氧化应激及凋亡相关蛋白

测定脑组织中Nrf 2、HO-1、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表达。每组取3只大鼠，分别取适量病变区域的大脑皮质，向其中加入裂解液，提取蛋白后计算蛋白浓度。后经蛋白凝胶电泳、转膜、封闭液封闭2 h、漂洗，然后与一抗在4℃条件下孵育过夜，次日取出TBST漂洗后加入二抗孵育2 h。将目标条带置于成像分析仪分析灰度值。计算相对条带灰度值，相对条带灰度值=目的条带灰度值/内参条带灰度值。

1.4 统计分析方法

数据运用SPSS 25.0软件进行数据分析，文中统计图用GraphPad Prism 8软件绘制，符合正态分布的数据结果以均数±标准差表示，多样本间比较采用单因素方差分析，两独立样本间比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 神经功能缺损评分比较

与Sham组相比，Model组大鼠神经功能缺损症状较重，神经功能缺损评分升高（P<0.05）；与Model组相比，GCs组大鼠的神经功能缺损评分有所降低（P<0.05），见图1。

图1 各组大鼠神经功能缺损评分比较（n=10)

2.2 脑组织TTC染色结果

Sham组大鼠脑组织未见明显梗死病灶，与之相比，Model组大鼠的脑梗死面积百分比较大（P<0.01);GCs治疗组大鼠的脑梗死面积百分比较Model组降低（P<0.05），见图2。

图2 各组大鼠脑梗死面积比较（n=4)

2.3 氧化应激指标的比较

与Sham组相比，Model组大鼠血清中MDA的含量升高，抗氧化因子SOD以及GSH-Px的活性下降（P<0.05）；而GCs组大鼠相较于Model组大鼠，MDA含量降低，SOD及GSH-Px的活性升高（P<0.05），见表1。

表1 三组大鼠各指标比较（n=3)

2.4 脑组织中相关蛋白的表达情况

与Sham组相比，Model组大鼠脑组织中Nrf 2、HO-1表达水平降低；与Model组相比，GCs组Nrf 2、HO-1表达水平升高（P<0.05）。与Sham组相比，Model组大鼠脑组织中凋亡相关蛋白Bax、Caspase-3的表达水平升高；与Model组相比，GCs组Bax及Caspase-3表达水平降低（P<0.01）。与Sham组相比，Model组大鼠脑组织中Bcl-2表达水平降低；与Model组相比，GCs组Bcl-2表达水平升高（P<0.01）。见图3。

3、讨论

众所周知，多因素多环节共同参与了CIRI后续的神经细胞坏死，在有效的时间内抑制其病理过程的发生发展对于疾病预后极为关键。Wang等[4]发现给与GCs治疗对CIRI大鼠的神经功能缺损和脑梗死面积的改善证实了其对脑组织损伤及发病后运动功能恢复的积极作用；本实验结果也证明了CIRI后大鼠经GCs治疗后神经功能缺损评分降低，脑组织梗死面积百分比降低，提示GCs对于CIRI后的脑损伤具有保护作用。

图3 各组大鼠脑组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3、HO-1、Nrf 2蛋白的表达比较

Nrf 2作为一种细胞内参与氧化还原反应重要的调控因子，在很多疾病的发生中发挥着重要的作用，例如神经变性疾病、肿瘤、衰老等[9]。其发挥抗氧化作用是通过结合抗氧化反应元件（antioxidant response elements,ARE）后，促进下游SOD、CAT和GSH-Px的表达[10]。HO-1作为Nrf 2/ARE通路的调控蛋白，它的激活可以启动抗氧化应激、抗炎、抗细胞损伤的保护机制[11]。HO-1可促进血红素的氧化降解，中和过量的活性氧，其上调是细胞适应氧化应激的重要机制。HO-1可以对抗氧化应激对于机体的损伤，从而减少细胞凋亡[12]。

在CIRI发生后，氧自由基过量产生会导致其生成和降解的失衡，活性氧堆积导致细胞受到过量的活性氧攻击。SOD、GSH-Px作为重要的抗氧化因子，其缺失可促进脂质过氧化，细胞毒性物质MDA的生成将进一步增加，进而出现一系列的细胞功能障碍，加重脑损伤[13]。Wang等[14]研究发现，通过提高SOD、CAT和GSH-Px的活性，降低MDA和蛋白羟基含量，可以提高血清、肝脏和大脑的抗氧化能力。叶红霞等[15]在GCs对小鼠的促智研究中发现，其通过提高抗氧化酶活性，降低氧化应激水平来减轻脑组织结构和功能的破坏。Wang等[4]前期的研究证实了GCs处理后促进神经元重塑及血管生成，其机制可能与激活Nrf 2通路，减轻脑组织氧化应激水平有关。本实验结果显示，GCs上调了Nrf 2及其下游靶蛋白HO-1的表达，提高了脑组织中抗氧化酶SOD及GSH-Px的活性，可以加速氧自由基的清除，也降低了细胞毒性物质MDA的堆积，从而减轻氧化应激诱导的脑损伤。

吴江立等[16]研究表明，Nrf 2也可以直接调控线粒体介导的内源性细胞凋亡途径，调节蛋白Bax和Bcl-2的表达而抑制细胞凋亡。研究发现，GCs可显著上调心肌组织中Bcl-2表达，下调Bax以及Caspase-3的表达，降低因缺血再灌注而引发的细胞凋亡，从而减轻心肌损伤[17]。在GCs对肿瘤的生长和转移影响的研究中发现，其通过调控Bax和Bcl-2蛋白的表达来发挥促凋亡作用，内皮细胞的增殖被抑制后，血管的生成也随之减少[18]。本实验研究结果显示，GCs干预提高了脑组织中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，降低了促凋亡蛋白Bax及Caspase-3的表达，充分证明了其对于神经细胞的存活有正向促进作用。

综上所述，GCs可能通过激活Nrf 2/HO-1通路，提高缺血半暗带区神经细胞抗氧化应激损伤的能力，减少CIRI所引起的神经细胞凋亡，提示GCs可能是一种潜在的治疗脑缺血再灌注后级联脑损伤的药物。

参考文献:

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