帕金森病（Parkinson's disease,PD）是神经退行性疾病，病理特征为中脑黑质区致密部多巴胺能神经元渐进性变性甚至丢失，继而引发黑质区致密部多巴胺及其代谢产物含量显著减少[1,2]。异常α-突触核蛋白聚集、线粒体功能障碍、自噬障碍和神经炎症等也会导致PD的发病[3,4]。

自噬相关因子自噬效应蛋白Beclin1、自噬标志物微管相关蛋白1轻链3β(Microtubule-associated protein 1 light chain 3β,LC3B）、P62选择性自噬接头蛋白1(Sequestosome1,SQSTM1/p62）在PD的细胞模型和动物模型中都发挥重要作用，当这些自噬相关因子的表达上调时，能够减少胞浆内蛋白聚集和相关细胞的死亡[5,6]。之后通过选择性细胞自噬可以保持线粒体的相对稳定状态，这对于细胞内能量的供给、物质的新陈代谢和正常的细胞凋亡途径都有很重要的影响。因此，激活自噬可能是改善帕金森病的一种治疗方法[7]。

已有研究表明，频繁使用西药治疗PD，易出现药物耐受性以及其他不良反应，但通过中药干预PD的多种发病机制，在延缓甚至医治PD的过程中产生的不良作用较少[8]。已有数百年药用史的香青兰（Dracocephalum Moldavica.L）主要的活性成分是香青兰总黄酮（total flavones of Dracocephalum moldavica L.,TFD），具有补益心脑、活血化痰、止痛消炎等功效[9,10]。本团队前期研究发现TFD可有效控制脑缺血再灌注后的炎症反应，减少脑梗死面积及组织病理学改变，并且TFD可通过抑制Caspase-3、Bax蛋白表达、激活Bcl-2蛋白表达介导的细胞凋亡途径，发挥神经保护作用[11,12]。自噬和凋亡互相影响和制约，但TFD的保护作用是否可以从介导自噬的角度改善神经损伤方面的探究还未被证实，因此，本研究通过TFD对PD模型小鼠的作用探讨其保护机制。

1、材料与方法

1.1 实验动物

从北京维通利华有限公司统一购入120只雄性2月龄、体重为22～25 g、无特异病原级（specific pathogen free,SPF)C57BL/6小鼠[SCXK（京）2019-0010]。实验小鼠按照《实验动物护理和使用指南》，饮水进食于室温（22±1）℃SPF级操作房中进行。

1.2 主要试剂与药品

香青兰购自内蒙古通辽地区；1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）购自Sigma Ltd（美国），TH、P62、LC3B、Beclin 1抗体购买自Affinity Biosciences Ltd；戊二醛、抗荧光衰减封片剂（含DAPI）购自Solarbio Ltd (BEI-JING);Talent荧光定量检测试剂盒购自TIANGEN BIOTECH (BEIJING) Co.LTD;Trizol试剂购自北京中杉金桥科技有限公司；PCR试剂盒购自Sangon Biotech(SHANG HAI) Co.LTD。

1.3 香青兰总黄酮化合物的分离提取

(1）先将购自内蒙古通辽地区的香青兰植物茎叶部分挑出并用粉碎机研磨成粗粉，过40目筛，放置于通风干燥处备用。（2）称取50 g香青兰植物粗粉放入锥形瓶内，向锥形瓶内加入1 500 mL 65%乙醇溶液，封口膜封口，过夜室温浸泡。（3）将锥形瓶置于超声洗涤器内，温度设定为60℃，当锥形瓶内温度达到60℃时，持续30 min。（4）将香青兰混合物液体冷却至室温。（5）香青兰混合物液体转移到真空抽滤瓶内，上口连接布氏漏斗并用滤纸紧密贴好漏斗口，侧口则连接真空抽滤器，打开真空抽滤器开关，将混合物倒入漏斗，使液料分离达到过滤的目的。（6）过滤后的药物液体需转移至蒸发瓶内（总液体体积应不超过瓶体积2/3），并用防爆球连接蒸发瓶与蒸发器转轴。保持真空抽滤器工作，旋转真空阀将压力控制在0.04 MPa左右，最后用瓶口夹固定收集瓶。向水浴锅加水后，调整蒸发瓶位置将其浸入水中，使瓶内液体液面与水浴锅内水平面相平或稍下。打开旋转蒸发仪电源，水浴锅加热水温至60℃，调整转速保持蒸发瓶匀速转动，同时观察药物液体是否爆沸，如有爆沸需调整真空阀以免液体倒吸。（7）将药物液体旋蒸至黏稠状且冷凝管内不再有水滴滴落，将旋蒸转速调整为0，关闭加热开关同时将旋蒸瓶上升至离开水浴锅水面，打开真空阀。取下收集瓶，将收集瓶内液体回收。倒出旋蒸瓶内液体至托盘内。（8）将盛有浸膏的托盘放入烘箱，60℃直至干燥。（9）用药匙将干燥后的浸膏刮出，用研钵研磨成粉，-20℃保存备用。

1.4 香青兰总黄酮总含量的测定

1.4.1 标准曲线溶液的配制

(1）称取5 mg芦丁，甲醇溶解定容到25 mL容量瓶。（2）称取1.25 g氢氧化钠，去离子水溶解定容到25 mL容量瓶，标记5%NaOH溶液。（3）称取2.50 g硝酸铝，去离子水溶解定容到25 mL容量瓶，标记10%Al(NO3)3溶液。（4）称取1.25 g亚硝酸钠，去离子水溶解定容到25 mL容量瓶，标记5%NaNO2溶液。

1.4.2待测物溶液的配制

(1）称取10 mg待测物，甲醇溶解定容到25 mL容量瓶。（2）称取1.25 g氢氧化钠，去离子水溶解定容到25 mL容量瓶，标记5%NaOH溶液。（3）称取2.50 g硝酸铝，去离子水溶解定容到25 mL容量瓶，标记10%Al(NO3)3溶液。（4）称取1.25 g亚硝酸钠，去离子水溶解定容到25 mL容量瓶，标记5%NaNO2溶液。

1.4.3标准曲线的制作

在7支10 mL比色管中分别加入0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL芦丁溶液。每支比色管中加入5%NaNO2溶液0.3 mL，震荡反应6 min。每支比色管中加入10%Al (NO3)3溶液0.3 mL，震荡反应6 min。每支比色管中加入5%NaOH溶液4.0 mL，震荡混匀。每支比色管中加入甲醇定容到10.0 mL，混匀15 min。最后利用紫外分光光度计在510 nm波长下分别测量每只比色管的吸光度值（仪器提前预热20 min）。用0 mL作为空白对照。

1.4.4总黄酮含量的测定

称取10 mg总黄酮(m），甲醇溶解定容到25 mL(V1）容量瓶，在3支10 mL比色管中分别加入3 mL总黄酮溶液（V2），再向每支比色管中加入5%NaNO2溶液0.3 mL，震荡反应6 min,10%Al(NO3)3溶液0.3 mL震荡反应6 min,5%NaOH溶液4 mL震荡混匀，加入甲醇定容到10 mL(V3），混匀15 min，分别测量510 nm波长下的吸光度值，然后依据吸光度计算出标准曲线并算出总黄酮的浓度（C）。根据公式计算出：总黄酮含量（%）=（样品OD值-标曲截距）标曲斜率*10/3*25/10。

1.5 动物分组

120只小鼠被随机分为正常对照组20只和观察组100只。连续7 d对观察组小鼠腹腔注射30 mg/（kg·d) MPTP以制备PD小鼠模型，以及对照组小鼠腹腔注射等体积生理盐水，然后再将观察组小鼠随机分为5组，分别为TFD治疗组[25、50、75、100 mg/（kg·d）]和模型组；连续1个月，治疗组按照小鼠的体重计算给药量进行灌胃，正常对照组和模型组小鼠按照上述方法计算出生理盐水的量进行灌胃。

1.6 药物配置

按小鼠体重对应MPTP、TFD为0.01 mL/g，因此设置MPTP浓度为3 mg/mL;TFD浓度为2.5 mg/mL、5 mg/mL、7.5 mg/mL、10 mg/mL。

1.7 行为学评价实验

实验前1周进行行为学训练，在最后一次灌胃后进行行为学检测。

1.7.1 悬挂实验（suspension experiments）检测小鼠的肌张力情况

取30 cm×25 cm×20 cm的木箱，贴近上面1 cm处悬挂一长35 cm粗1 mm铁丝。将小鼠两只前爪挂于铁丝上，让其停留在铁丝上大约10 s。10 s内，如果小鼠跌落记为0分，只剩1只前爪挂在铁丝上记1分，两只前爪挂于铁丝上记2分，2只前爪以及1只后爪挂在铁丝记3分，4只爪都抓住铁丝记4分。每只小鼠每次实验间隔至少30 min，共做3次，取3次实验的平均值。

1.7.2 转棒实验（rotating rod experiment）检测小鼠的运动能力及协调能力

将小鼠放置于转棒滚轮上，启动疲劳仪。疲劳仪转速保持25 r/min持续150 s，当小鼠从转棒上跌落下来时实验箱内红外装置会自动记录其掉落潜伏期。在一次转棒实验完成后放置新一只小鼠之前需要将底部托盘和滚轮擦拭干净并喷洒酒精掩盖上一只小鼠所留下的气味，避免对实验结果产生影响。每只小鼠重复3次，每次间隔至少30 min，取3次实验的平均值。

1.7.3 旷场实验（open fieldexperiment）判断MPTP损伤后，小鼠在新异环境中的自由活动状况

旷场环境安静，旷场箱内底板须保证清洁无异味，将每只小鼠头部朝向同一个方向摆放于旷场箱底板正中央，使小鼠可以自由活动5 min。同时，旷场上方的摄像头会自动追踪小鼠活动轨迹。每只实验动物测试结束后，都必须将旷场底板擦拭干净并用酒精掩盖上一只小鼠实验时所留下的气味，以防止对实验结果产生不利影响。此实验为非重复性实验，仅以1次实验数据进行统计分析。

1.8 分子生物学实验和形态学实验

1.8.1 组织取材

取材前12 h内小鼠禁食不禁水，按照10 mL/kg水合氯醛（10%）剂量麻醉小鼠，小鼠完全麻醉后进行组织取材。（1）将一部分麻醉后的小鼠沿腹中线剖开，在暴露的心尖处进针采血，室温静置30 min后，4 000 r/min离心15 min，取得的上清置于-80℃冰箱保存。取血后的小鼠快速断头取脑，于冰上分离出中脑黑质区，-80℃保存，以待分子生物学实验使用。（2）剩余小鼠进行内外固定处理。开胸暴露心脏，于心尖处进针，快速灌注约250 mL生理盐水，同时剪开心脏右心耳，直至右心耳处流出清亮生理盐水后，再缓慢灌注4%多聚甲醛（约250 mL），待小鼠尾巴及四肢出现僵硬、痉挛，从口鼻流出大量多聚甲醛溶液后，灌注结束。颈部断头取脑，用4%多聚甲醛将小鼠的全脑组织进行后固定，形态学实验备用。

1.8.2 免疫荧光组织化学实验

首先，烘箱65℃放置包埋好的脑组织石蜡切片，烘烤2 h。然后，将二甲苯脱蜡和梯度酒精水化后的切片放置于柠檬酸盐溶液，微波炉高火抗原修复7 min，恢复至室温后，用PBS缓冲液洗片3次，5 min/次；用PBS-Triton配置的10%山羊血清封闭30 min，洗片后滴加一抗，于湿盒内4℃孵育过夜。第2天，洗片后滴加荧光标记的二抗（1∶1 000），室温孵育2 h，再次洗片，用含DAPI的抗淬灭封片剂进行封片处理；荧光显微镜下观察并采集图像进行保存。

1.8.3 荧光定量PCR实验

Trizol法提取脑组织中总RNA。按照cDNA First-Strand Synthesis Kit的说明将RNA逆转录成cDNA。按照Talent qPCR PreMix(SYBR Green) Kit和Roche light Cycler 96实时荧光定量PCR仪器检测系统的说明，通过实时定量PCR检测Ct值。Real Time PCR仪器上机，设置Real Time PCR反应程序95℃600 s预变性，之后PCR循环（×40循环）：95℃10 s、60℃30 s、95℃10 s，最后65℃60 s延伸。设置3个复孔，每次扩增均设置β-actin为内参基因，PCR引物由生物工程有限公司设计和合成。见表1。

1.8.4 Western-blot检测

取中脑黑质区脑组织加入蛋白裂解液以及蛋白酶抑制剂充分裂解后离心取上清，得到总蛋白原液，根据牛血清白蛋白法（BCA）测量蛋白质浓度，制样。100℃金属浴中煮沸5 min使蛋白质变性。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脱脂奶粉进行封闭，洗膜过后加入一抗[β-actin(1∶1 000）、酪氨酸羟化酶（TH)(1∶1 000）、P62(1∶500）和LC3B(1∶500)],4℃孵育过夜。第2天洗膜后，将它们与相应的二抗（1∶1 000）孵育1.5 h，孵育后洗涤。最后通过超敏化学发光液曝光，通过Image J进行分析。

表1 引物序列  

1.9 数据统计处理与分析

使用Graphpad Prism软件进行数据统计分析，计量资料以均数±标准差表示，进行方差齐性检验。多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），进一步两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为具有统计学意义。

2、结果

2.1 香青兰总黄酮化合物的分离提取和含量测定

经旋转蒸发仪减压蒸馏得到香青兰总黄酮化合物提取物，电子天平称量为50.5 g；经紫外分光光度计测量，按表内数据绘制标准曲线，横坐标为浓度，纵坐标为OD值，如图1所示。三次测得OD值（0.308、0.374、0.355）取均值为纵坐标值代入标准曲线方程式（样品OD值-标曲截距）标曲斜率*10/3*25/10，得到黄酮浓度约为33.64%。

图1 总黄酮含量测定的标准曲线   

2.2 TFD对PD模型小鼠运动功能的影响

在悬挂实验中，与正常对照组相比，模型组与TFD治疗组悬挂评分降低（P<0.05);TFD各治疗组悬挂评分高于模型组（P<0.05）。在转棒实验中，与正常对照组相比，模型组以及所有TFD治疗组下落潜伏期均降低（P<0.05）；除25 mg/kg TFD治疗组外，其余治疗组下落潜伏期高于模型组（P<0.05）。在旷场实验中，与正常对照组相比，模型组小鼠运动距离减少（P<0.05）；除100 mg/kg TFD治疗组外，其余TFD治疗组的运动距离长于模型组（P<0.05）。见图2。

图2 TFD对PD模型小鼠运动功能的影响   

2.3 TFD对黑质区TH、P62阳性细胞表达的影响

免疫荧光实验结果显示，绿色为阳性表达，蓝色为细胞核。与正常对照组相比，模型组TH表达水平显著降低；与模型组相比，TFD治疗组TH、P62的表达水平均有不同程度上调。见图3、图4。

图3 免疫荧光染色检测中脑黑质区TH的表达（100×）   

图4 免疫荧光染色检测中脑黑质区P62的表达（100×）   

2.4 TFD对脑组织内TH、LC3B、P62、Beclin1 mR-NA水平的影响

与正常对照组相比，模型组TH、Beclin1、LC3B mRNA表达水平降低（P<0.05),P62表达水平无明显变化（P>0.05）；与模型组相比，100 mg/kg TFD TH mRNA表达水平明显上调（P<0.05），所有治疗组LC3B mRNA表达水平增加（P<0.05),50、75 mg/kg TFD治疗组P62表达水平增加（P<0.05),25 mg/kg TFD治疗组Beclin1 mRNA表达水平增加（P<0.05）。见图5。

图5 TFD对脑组织TH、LC3B、P62、Beclin1 mRNA表达水平的影响   

2.5 TFD对脑组织内TH、P62、LC3B、Beclin1蛋白表达水平的影响

与正常对照组相比，模型组及所有TFD治疗组的TH蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）；与模型组相比，100 mg/kg TFD治疗组TH蛋白表达水平上调（P<0.05）。与正常对照组相比，模型组P62、LC3B、Beclin1蛋白表达水平均降低（P<0.05）；与模型组相比，除100 mg/kg TFD治疗组外，其余治疗组P62、LC3B蛋白表达水平均上调，25、50 mg/kg TFD治疗组Beclin1蛋白表达水平上调（P<0.05）。见图6。

图6 TFD对脑组织TH、LC3B、P62、Beclin1蛋白表达水平的影响   

3、讨论

本课题组之前的研究表明，TFD可通过抑制Caspase-3、Bax蛋白表达、激活Bcl-2蛋白表达介导细胞凋亡途径，从而发挥神经保护作用[11,12]。本研究发现TFD在调节自噬方面也有着积极的作用，主要表现为用药后P62、LC3B蛋白表达水平均上调，25、50 mg/kg TFD治疗组Beclin1蛋白表达水平上调，该研究证实自噬的上调可能是TFD发挥保护作用的机制之一，表明香青兰总黄酮有望成为防治PD的药物，但其确切的治疗机制还需更深入地研究。

酪氨酸羟化酶（TH）是多巴胺合成过程的限速酶，其活性程度可直接反映组织内多巴胺水平，作为检测PD模型制备是否成功的关键指标。本研究结果表明，100 mg/kg TFD治疗组小鼠的黑质区TH蛋白表达水平上调，这在形态学上也得到了充分的证实，表明TFD可对PD模型小鼠黑质多巴胺能神经元产生保护效果。机体选择性自噬可以保持神经元线粒体的相对稳定状态，对于细胞内能量的供给、物质的新陈代谢和正常的细胞凋亡产生重要的影响。Beclin1、LC3B、P62蛋白共同参与自噬的发生。研究发现，LC3有3种亚型，包括LC3A、LC3B和LC3C，当LC3蛋白合成后立即在其羧基端被Atg4所剪切，才产生细胞浆定位的LC3-I，在自噬过程中，LC3-Ⅰ被包括Atg7和Atg3在内的泛素样体系所修饰和加工，产生分子量为14 kD的LC3-Ⅱ。这样，自噬小体中存在的LC3和LC3-Ⅱ都被当作细胞发生自噬的分子标志，并且LC3-Ⅱ的含量和发生自噬的程度成正比，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可估计自噬水平的高低。LC3B作为LC3的一种，可以作为自噬的分子标志物。

本实验中，模型组LC3B、P62、Beclin1的蛋白表达量显著下降，表明模型组小鼠自噬功能异常，而TFD治疗组可以提高LC3B、P62、Beclin1蛋白的表达量，并且可以作用于转录水平，提示TFD处理可能激活线粒体自噬，改善PD模型小鼠神经细胞正常的程序性自噬功能。因为自噬接头蛋白P62与底物结合后会随着自噬的持续进行而受到溶酶体的降解，所以通常情况下P62的表达与自噬活性呈负相关，P62表达水平的升高也通常被认为是自噬受到抑制的标志。但鉴于细胞自噬过程本身是一个持续动态的状态，在评价细胞自噬活性时，必须综合考虑自噬流的动态变化[13]。P62水平升高亦可与自噬激活同时出现。本研究结果发现TFD可上调P62的表达，但具体机制尚不明确，需进一步研究。

前期课题组使用TFD去治疗脑缺血再灌注的大鼠模型，从蛋白组学、基因组学、形态学以及行为学实验中已经发现100 mg/kg TFD对PD模型组炎性因子、氧化应激指标及多巴胺能神经元数量的影响最为明显，50 mg/kg、75 mg/kg TFD组则对线粒体自噬相关蛋白的影响最明显，结合表达TH的黑质区多巴胺能神经元的数量综合分析，推测多巴胺能神经元的存活状态可能与炎症和氧化应激的关系极为密切，而且TFD在自噬的调节过程中可能起到双向调节作用。

综上所述，香青兰总黄酮能够改善MPTP诱导的PD模型小鼠运动功能障碍，并且减少了小鼠大脑黑质区多巴胺能神经元丢失，可能通过调节细胞自噬对PD模型小鼠神经起到了保护作用。

参考文献:

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[10]奇玲,罗达尚.中国少数民族传统医药大系[M].呼和浩特:内蒙古科学技术出版社,2000:397-398.

[12]周丽丽,莫超然,刘心朗,等.蒙药香青兰总黄酮对帕金森病模型小鼠的神经保护作用[J].中国比较医学杂志,2021,31(5):41-46.

基金资助:内蒙古自治区自然科学基金面上项目(2020MS08011);

文章来源:索耀文,莫超然,杨占君.香青兰总黄酮通过介导自噬改善帕金森病模型小鼠的神经损伤的作用[J].包头医学院学报,2023,39(12):1-7.