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APOC3表达抑制剂筛选模型的构建及意义

2023-12-26 47 上传者：管理员

摘要：目的构建APOC3表达抑制剂筛选模型，并从中药单体化合物中筛选APOC3表达抑制剂。方法利用PCR方法扩增APOC3基因启动子，利用基因重组技术构建启动子驱动的荧光素酶报告载体；通过荧光素酶活性检测筛选APOC3表达抑制剂；利用RT-qPCR方法检测APOC3的mRNA表达水平，利用Western blot方法检测APOC3的蛋白表达水平；利用oxLDL诱导肝细胞中的脂质沉积，之后利用油红O染色法检测细胞内的脂质沉积情况。结果 APOC3表达抑制剂筛选模型构建成功，用该筛选模型筛选中药单体化合物，发现千层纸素A可抑制APOC3基因启动子活性，并进而抑制APOC3 mRNA和蛋白的表达水平。进一步的研究显示，千层纸素A可抑制oxLDL诱导的肝细胞中的脂质沉积。结论本研究构建的筛选模型可用于APOC3表达抑制剂的筛选，且筛选到的化合物千层纸素A可抑制脂质沉积。

关键词：
动脉粥样硬化
化合物筛选
筛选模型构建
血浆甘油三酯
载脂蛋白C3
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人载脂蛋白C3(Apolipoprotein C3,APOC3)是富含甘油三酯(TG)的脂蛋白(Triglyceride rich lipoproteins, TRLs)及高密度脂蛋白的主要成分，在调节血浆甘油三酯水平中起重要作用，与血浆TG水平呈正相关，含有APOC3的高密度脂蛋白与颈动脉斑块的形成、缺血性脑卒中和脑梗死、痴呆和大脑中β-淀粉样蛋白沉积等的发生风险密切相关[1,2,3]。研究显示，APOC3可直接促进单核细胞向血管内皮细胞的黏附，引起炎症反应，进而促进脂代谢相关疾病——动脉粥样硬化的发生[4]。以上研究提示，下调APOC3的表达可能是治疗脂代谢异常疾病的有效途径之一。因此，本研究钓取了APOC3的启动子，构建了APOC3表达抑制剂筛选模型，并从中药单体化合物中筛选APOC3表达抑制剂，之后鉴定了化合物对APOC3表达的抑制作用，报道如下。

1、材料与方法

1.1 主要材料

用于筛选的中药小分子化合物购自中国食品药品检定研究院，纯度均在98%以上，用DMSO溶液配成10 mg/mL的母液，储存于-20℃冰箱中备用。进行筛选时，用DMSO稀释成5 μg/mL的工作液进行使用。抗APOC3(ab21032)抗体购自英国Abcam公司，抗GAPDH抗体购自上海康成生物有限公司，HRP标记的羊抗鼠IgG、兔IgG均购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。人氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)购自广州奕源生物技术公司，油红O购自Sigma-Aldrich公司。

人胚肾细胞HEK 293T、人正常肝细胞L02购自ATCC细胞库，由本实验室保留和冻存。DNA提取试剂盒购自常州百代生物科技股份有限公司。

1.2 pAPOC3-luc质粒的构建

收集培养好的L02细胞用PBS洗涤后，按厂家提供的说明书提取基因组DNA,之后以L02细胞基因组DNA为模板，用特异性引物对APOC3启动子(-1 451～+39 bp)片段进行PCR扩增，引物序列如下：上游：5’-GGGGTACCGAGGAATTCCAAGTCTC-3,下游：5’-CCCAAGCTTGGGCATTACCTGGAGCAG-3。回收PCR片段，将该片段和pGL2-Basic载体分别用KpnⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切，之后分别回收片段和载体，用T4 DNA连接酶进行连接。用连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,之后涂布于Amp+LB营养琼脂平板上，次日挑取单菌落接种到LB培养基中培养细菌，之后提取质粒，电泳鉴定后送去测序公司测序。

1.3 细胞培养

人正常肝细胞系L02和人胚肾细胞HEK 293T培养于含10%新生牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM完全培养基中，置于恒温37℃,5% CO2的细胞培养箱中培养。

1.4 细胞转染

准备2支1.5 mL离心管，其中1管加入100 μL CaCl2溶液，同时将2.5 μg质粒DNA加入并混匀。另1管加入100 μL BBS溶液，将混好质粒的CaCl2溶液分数次加入BBS溶液中，边加边吹打混匀。室温静置20 min, 随后将混合液加入到待转细胞孔中，轻摇培养板混匀。培养4 h后，弃去原细胞培养液，加入完全培养基。

1.5 APOC3表达抑制剂的筛选

取对数生长期的HEK 293T细胞，用磷酸钙法转染pAPOC3-luc质粒，4 h后，消化细胞，以2×104个/孔的密度接种于96孔细胞培养板中。转染24 h后，弃去培养液，加入终浓度为5 μg/mL的中药单体化合物(用完全培养基稀释),对照为等体积的DMSO稀释液(用完全培养基稀释),对照组和实验组均设置3个复孔。24 h后进行荧光素酶活性检测，筛选可明显抑制APOC3启动子活性的单体化合物。

1.6 荧光素酶活性检测

以24孔板培养的细胞为例，将各孔细胞分别收集到1.5 mL离心管中，离心，弃上清。每管加入500 μL预冷的PBS重悬细胞，4℃离心，弃上清。每管加入100 μL细胞裂解液，-20℃静置20 min, 取出后室温溶解，4℃离心，上清即为细胞裂解液。在96孔荧光素检测白板中加入5 μL荧光素酶活性分析缓冲液，并加入45 μL细胞裂解液，混匀，随后加入100 μL荧光素反应液，立即放入BMG荧光化学发光检测仪中，启动程序检测活性。

1.7 千层纸素A(Oroxylia A,OA)对APOC3 mRNA表达的影响

在6孔细胞培养板中接种5×105个/孔的L02细胞，培养24 h后，加入15 μg/mL的OA,对照组用等体积的DMSO处理，24 h后，弃去培养基。用TRIzol法提取总RNA。使用逆转录试剂盒，按照说明书操作将mRNA逆转录为cDNA。使用LightCycler 480 SYBR Green I Master, 按照产品说明书操作。用PikoReal SW-software version 2.0(Thermo Fisher Scientific)分析结果。每个样品进行至少3次重复实验，以β-actin为内参，进行数据归一化处理。PCR 引物如下，APOC3-F:5’-AGGAGTCCCAGGTGGCCCAGCAG-3’,APOC3-R:5’-CACGGCTGAAGTTGGTCTGACCTCA-3’;β-actin-F:5’-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3’,β-actin-R:5’-ACCAGAGGCATACAGGGACA-3’。

1.8 OA对APOC3蛋白表达的影响

在6孔板中培养L02细胞，实验组加入15 μg/mL的OA,对照组用等体积的DMSO稀释液代替，作用细胞24 h后，提取蛋白，并按比例加入4×蛋白上样缓冲液，于100℃孵育10 min。制备聚丙烯酰胺凝胶(12%分离胶和5%压缩胶),在每个上样孔中加入10 μL制备好的蛋白样品，上层胶80 V恒压电泳30 min, 下层胶120 V恒压电泳1 h。电泳结束后将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白转到PVDF膜上，恒压100 V转印2 h。取出PVDF膜，洗涤后放入封闭液中，摇床上室温振荡封闭1 h。弃去封闭液，洗涤后将PVDF膜放入已预先加入对应抗体的稀释液中，4℃摇床孵育过夜。次日洗涤后将膜用二抗室温摇床孵育1 h。最后使用ECL显影，凝胶成像仪成像。

1.9 油红O染色法检测细胞脂质沉积

将处于对数期生长的L02细胞消化成单细胞悬液，以1×105个/孔的密度接种于24孔细胞培养板中的盖玻片上，培养24 h后，建模组加入80 mg/mL oxLDL溶液，化合物组加入80 mg/mL oxLDL溶液的同时加入15 μg/mL的OA,对照组用等体积的DMSO稀释液代替。24 h后洗涤盖玻片，加4%细胞固定液固定细胞30 min, 加入油红O染色液(加的体积覆盖住板底即可),室温放置10 min, 用真空泵吸去染色液，用60%异丙醇漂洗脱色，除去多余的染料，迅速用真空泵吸去，甘油封片，于显微镜下观察拍照。

1.10 统计学分析

本研究实验结果均重复3次以上。对实验数据分析的统计学检验方法为两组比较用双尾t-Test法，3组以上比较用one way ANOVA;P<0.05表示差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 pAPOC3-luc荧光素梅报告质粒的构建

以L02细胞的基因组DNA为模板，用特异性引物对APOC3启动子区域(-1 451～+39 bp)进行PCR扩增，并将扩增片段用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。结果如图1所示，1号泳道1 500 bp左右的位置可以看到一条清晰的条带，与设计钓取的APOC3启动子片段大小基本一致。

随后根据预先设计的引物中加入的酶切位点KpnⅠ和HindⅢ对钓取的片段和目的载体pGL2-Basic进行双酶切。随后回收酶切片段进行连接，并转化入DH5α菌株。挑取单克隆菌落，过夜培养扩增转化菌，并提取重组质粒，进行琼脂糖凝胶电泳分析。结果如图2所示，与pGL2-basic质粒条带位置相比，重组质粒的条带位置明显滞后，疑似已连接入目的片段。之后送上海生工测序，结果显示，重组质粒构建成功。

2.2 pAPOC3-luc中的启动子活性分析

为了检测所钓取的启动子是否具有活性，在HEK 293T细胞中分别转入pGL2-basic或pAPOC3-luc质粒，48 h后检测细胞中的荧光素酶活性。结果如图3所示，转入pAPOC3-luc的细胞其荧光强度明显高于转入pGL2-basic的细胞。

2.3 抑制APOC3表达的中药单体化合物的筛选

将前面所构建的pAPOC3-luc转染入HEK 293T细胞中，24 h后分别加入中药单体化合物继续培养24 h, 收集细胞进行荧光素酶活性检测。结果如图4所示，化合物OA对APOC3基因的启动子活性有明显的抑制效果。

图1 APOC3启动子的PCR扩增

图2 重组质粒的电泳鉴定

图3 APOC3启动子的活性分析

2.4 OA对APOC3 mRNA和蛋白表达的影响

在mRNA水平和蛋白水平检测了OA对L02细胞中APOC3表达的影响。结果显示，经15 μg/mL OA作用24 h后，L02细胞中APOC3的mRNA(图5)和蛋白表达水平(图6)均明显下降。

2.5 OA对oxLDL诱导的肝细胞内脂质沉积的影响

用80 mg/mL oxLDL诱导L02细胞24 h, 发现oxLDL可以增加肝细胞中脂质的累积，而OA则对oxLDL诱导的脂质沉积有一定的抑制作用(见图7)。

图4 OA对APOC3启动子活性的影响

图5 Real-time RT-PCR法检测OA对APOC3 mRNA 表达的影响

图6 OA对APOC3蛋白表达的影响

3、讨论

APOC3 作为脂蛋白脂酶(Lipoprotein lipase, LPL) 抑制剂，可通过抑制脂肪酶、肝脂酶、胆固醇脂卵磷脂酰基转移酶的活性影响脂代谢，在调节脂代谢过程中具有十分重要的作用[5,6]。APOC3 基因缺失，或 APOC3 基因靶向断裂，或APOC3对LPL的抑制作用降低，都可导致血浆甘油三酯降低，因为LPL是TRLs分解代谢的关键酶，所以减少对LPL的抑制，就会加强脂解作用，加速TRLs分解，对抗HTG,从而对抗动脉粥样硬化(Atherosclerosis, As)[7,8]。反之，APOC3 基因在实验鼠体内过表达，则明显促进 As 的形成和发展[9]。

图7 OA对oxLDL诱导的L02细胞脂质累积的影响

APOC3 作为载脂蛋白家族中的主要成员，其重要性已日益引起科学界的重视，随着对 APOC3 生物学活性及作用机制的深入研究，发现APOC3 很可能会成为预防、治疗代谢综合征和动脉粥样硬化相关的心脑血管疾病等的新靶点[10,11]。

本研究通过基因重组技术，将APOC3的启动子片段克隆到荧光素酶报告载体pGL2-basic上，构建了由APOC3启动子驱动的荧光素酶报告质粒。将此质粒转染入真核细胞，利用APOC3的启动子活性驱动下游荧光素酶的表达，通过荧光素酶活性的高低判断APOC3启动子的强弱。基于该原理对本实验室的300多种中药单体化合物进行筛选，最后筛选到了OA,发现它可以有效抑制APOC3的启动子活性，并进一步在mRNA和蛋白水平上确定其可以抑制APOC3的表达。

千层纸素A 是从中药黄芩中提取的黄酮类化合物，其有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、神经保护、抗凝血、促进新生血管生成等多种生物学活性[12]。本研究发现，其具有抑制APOC3表达的作用，并可抑制细胞中的脂质沉积。

基金资助:吉林省科技发展计划项目(20220204015YY);

文章来源:刘思辰,郑丽华,柯超.APOC3表达抑制剂筛选模型的构建及意义[J].中国实验诊断学,2023,27(12):1469-1473.