支气管哮喘是一种常见的呼吸系统疾病，主要病理特征为气道高反应、气道炎症和气道重塑。有研究显示，哮喘发生发展往往伴有嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞、淋巴细胞等多种细胞炎症浸润和气道上皮细胞炎症损伤，可进一步加重机体炎症反应[1]。异甘草素是从甘草根茎中提取的一种黄酮类天然活性产物，现代药理实验证实，其具有抗炎、抗肿瘤、抗菌及保护肺组织等作用[2]。张霞[3]研究发现，异甘草素通过调控核因子-κB(nucleus factor-κB,NF-κB)通路和核因子相关因子2/血红素加氧酶-1通路改善慢性阻塞性肺疾病大鼠肺损伤，并减轻炎症反应。孙博蕊等[4]研究显示，异甘草素可能通过调控Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/NF-κB通路改善颅脑损伤大鼠炎症反应。本研究旨在探究异甘草素通过介导TLR4/NF-κB通路对湿热哮喘模型大鼠气道炎症的影响。

一、材料与方法

1材料

动物SPF级SD雄性大鼠，6周龄，体质量(210±10) g, 购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物许可证号：SCXK(鲁) 2019 0003,喂养温度(22±2) ℃,相对湿度(40±5)%,昼夜交替各12 h, 待SD大鼠适应本环境1周后进行实验。本实验经青岛大学附属青岛市海慈医院动物伦理委员会批准(伦研批第：NO.2022HC10LS056)。

药物与试剂异甘草素，纯度：98%,批号：BP0787,购于成都普瑞法公司；地塞米松片，规格：每片0.75 mg, 批号：20211225,批准文号：国药准字H44024469,购于广东华南药业集团有限公司。卵清蛋白(ovalbumin, OVA),购于美国Sigma公司；白细胞介素(interleukin, IL)-13试剂盒、IL-4试剂盒，均购于上海江莱生物科技有限公司；TLR4抗体、p-NF-κB p65抗体、NF-κB p65抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗体、羊抗兔HRP标记二抗，均购于英国Abcam公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)试剂盒、聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜、电化学发光(electro-chemi-luminescence, ECL)试剂，均购于北京索莱宝科技有限公司；瑞氏染色试剂盒，购于上海雅吉生物科技有限公司。

仪器flexiVent小动物肺功能仪，加拿大SCIREQ公司产品；LD-96A全波长酶标仪，山东莱恩德智能科技有限公司产品；DYCZ-25D双垂直电泳仪、DYCP-31C琼脂糖水平电泳槽，均为北京六一生物科技公司产品；BX53-P光学显微镜，日本奥林巴斯公司产品。

2实验方法

2.1 模型建立

按参考文献[5]方法建立湿热哮喘大鼠模型。随机选取50只大鼠采用高脂高蛋白饮食+长时间湿热环境+OVA致敏激发的方法构建模型。致敏激发后大鼠出现烦躁不安、咳嗽、呼吸急促、点头样呼吸、伸颈、腹部抽搐、反应迟钝、口周发绀、挠鼻、大小便失禁等症状，视为哮喘造模成功；大鼠出现嗜卧少动、饮水下降、行动迟缓、理毛行为减少且伴毛发污浊、大便稀软或黏液伴臭秽、小便黄浊伴骚臭、肛周污秽、舌质红、舌苔黄腻等，视为湿热证造模成功。

2.2 实验分组与处理方法

50只模型大鼠造模成功后，在29 d开始灌胃给药，模型大鼠分为模型组、地塞米松组、低、中、高剂量实验组，另选取10只大鼠作为对照组。其中对照组、模型组给予灌胃10 mL·kg-1 0.9%NaCl, 地塞米松组给予灌胃地塞米松0.25 mg, 低、中、高剂量实验组给予灌胃10、20、40 mg·kg-1异甘草素，qd,持续灌胃至42 d。

2.3 哮喘症状评分[6]6]

末次给药实验结束后24 h, 观察各组大鼠抓鼻、挠痒、打喷嚏等哮喘行为学指标并对其进行打分，大鼠无抓鼻或挠痒动作，无哮喘症状，记0分；出现抓鼻或挠痒1～3次，记1分；出现抓鼻或挠痒4～6次，记2分；出现抓鼻或挠痒7次以上、轻微哮喘症状，各记3分；出现呼吸急促或呼吸频率加快或焦躁不安等症状，记6分；出现严重呼吸困难，记9分。

2.4 以小动物肺功能仪检测各组大鼠肺功能检测[7]7]

末次给药结束后24 h, 用小动物肺功能仪检测各组大鼠最大呼气流量(peak expiratory flow, PEF)、最大呼气中期流量(maximal mid-expiratory flow, MMEF)、用力肺活量(forced vital capacity, FVC)。

2.5 以瑞氏染色发检测各组大鼠炎症细胞计数[8]8]

麻醉处死大鼠，沿大鼠颈部切开表面皮肤，同时打开胸腔暴露肺组织，结扎右主支气管，按压大鼠胸前区，用0.9%NaCl 2 mL灌洗左肺，收集肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF),重复灌洗3次，取适量BALF低倍镜下在改良Neubauer计数板上计算4个大方格中白细胞总数(每升血液白细胞数),余下BALF,在4 ℃下以1 500 r·min-1离心10 min, 取细胞沉淀涂片、按照瑞氏染色试剂盒操作进行染色，瑞氏染色后在油镜下计数200个观察白细胞分类计数，即巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞。

2.6 以酶联免疫吸附法检测BALF和血清IL-13、IL-4水平[9]9]

收集各组大鼠BALF和外周血5 mL,外周血置于真空管内保存，在4 ℃下以2 000 r·min-1离心15 min收集上清液，酶联免疫吸附法检测IL-13、IL-4水平。

2.7 以苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色法检测大鼠肺组织的病理情况[10]10]

取大鼠肺组织右肺经0.9%NaCl冲洗，置于4%多聚甲醛抽气固定48 h, 常规乙醇脱水、二甲苯通透后，石蜡包埋切片(5 μm),行HE染色，然后导致显微镜下观察。

2.8 以蛋白质印迹(Western blot)法检测TLR4/NF-κB通路蛋白表达[11]11]

取各组大鼠肺组织加蛋白裂解液，用BCA法测定蛋白浓度，SDS凝胶分离蛋白，电泳结束转至PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭培养1 h, 4 ℃加一抗TLR4、p-NF-κB p65、NF-κB p65及内参GAPDH过夜孵育，洗膜3次加二抗37 ℃孵育1 h, 膜上加ECL试剂，X光胶曝光后显影、定影。Quantity One分析蛋白条带灰度值。

3统计学处理

用SPSS 25.0软件进行统计分析，计量资料用表示，多组间比较用单因素方差分析，事后比较用LSD-t检验。

二、结果

1 各组大鼠哮喘评分的比较

SD大鼠分对照组、模型组、地塞米松组和低、中、高剂量实验组，除对照组外，其余5组均建立湿热哮喘模型。建模成功后对照组、模型组给予灌胃0.9%NaCl, 地塞米松组灌胃给予地塞米松0.25 mg, 低、中、高剂量实验组给予灌胃10、20和40 mg·kg-1异甘草素，qd。

模型组低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组、地塞米松组哮喘症状评分分别为(6.47±0.78)、(5.34±0.75)、(3.95±0.42)、(1.14±0.32)和(0.94±0.13)分。与模型组相比，低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组、地塞米松组哮喘症状评分均显著降低(均P<0.05)。

2 各组大鼠肺功能的比较

与对照组相比，模型组MMEF、PEF、FVC均显著降低(均P<0.05);与模型组相比，低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组、地塞米松组MMEF、PEF、FVC均显著增加(均P<0.05),见表1。

3 各组大鼠BALF细胞炎症细胞计数的比较

与对照组相比，模型组巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞及炎症总细胞计数均显著增加(均P<0.05);与模型组相比，异甘草素低、中、高剂量组、地塞米松组巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞及炎症总细胞计数均显著降低(均P<0.05),见表2。

4 各组大鼠BALF和血清IL-13、IL-4水平

与对照组相比，模型组BALF和血清IL-13、IL-4水平均显著增加(均P<0.05);与模型组相比，低、中、高剂量实验组、地塞米松组BALF和血清IL-13、IL-4水平均显著降低(均P<0.05),见表3。

表1 各组大鼠肺功能最大呼气流量(PEF)、最大呼气中期流量(MMEF)、用力肺活量(FVC)比较

5 各组大鼠肺组织病理情况

对照组可观察道肺组织结构正常，气管黏膜细胞完整，管腔内光滑平整，肺泡间隔正常；模型组肉眼可见大鼠肺组织均匀膨胀，有明显水肿和充血、黏液栓，上皮细胞出现坏死，气道壁、平滑肌及基底膜明显增厚、管腔变窄，管壁有大量炎性浸润现象；地塞米松组上述情况有明显减轻，但病变部位有少量炎性浸润，上皮细胞结构较完整；低、中、高剂量实验组上述情况均有明显好转，且随着异甘草素剂量增加效果越明显，见图1。

表2 各组大鼠肺泡灌洗液(BALF)细胞炎症细胞计数比较

表3 各组大鼠BALF和血清白细胞介素(IL)-13、IL-4水平比较

图1 各组大鼠肺组织染色结果(苏木精-伊红染色， ×200)   

6 各组大鼠肺组织TLR4/NF-κB通路相关蛋白

对照组、模型组、低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组、地塞米松组TLR4蛋白表达水平分别为0.32±0.05、1.23±0.12、0.98±0.10、0.75±0.09、0.47±0.06和0.51±0.05,p-NF-κB p65蛋白表达水平分别为0.26±0.03、0.92±0.09、0.74±0.08、0.56±0.04、0.39±0.05和0.42±0.06。与对照组相比，模型组TLR4、p-NF-κB p65蛋白表达水平均显著增加(均P<0.05);与模型组相比，低、中、高剂量实验组、地塞米松组TLR4、p-NF-κB p65蛋白表达水平均显著降低(均P<0.05),见图2。

图2 用蛋白质印迹法检测Toll样受体4(TLR4)、核因子-κB p65(nucleus factor-κB p65,NF-κB p65)、磷酸化NF-κB p65(p- NF-κB p65)蛋白表达情况   

三、讨论

中医认为，哮喘多由外邪内湿致痰气交阻、闭塞气道，且肺升降失职所，外邪常由外感而来、内湿多由食积蕴郁而成，湿邪为患、易热化，故湿热证多见[12]。甘草属于豆科甘草属植物甘草的干燥根和根茎，具有润肺止咳、祛痰、清热解毒等功效，味甘性平，归肺、脾、胃经[13],已有研究发现，甘草具有多种活性成分，如异甘草素、甘草酸、香豆素等[14]。本研究给予灌胃不同浓度异甘草素发现，异甘草素呈剂量依赖性降低模型组大鼠哮喘症状评分、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞及炎症总细胞计数，增加肺功能MMEF、PEF、FVC指标，提示异甘草素可减轻湿热哮喘模型大鼠气道炎症损伤，并改善大鼠肺功能。

有研究显示，50%～70%哮喘患者与2型炎症有关，2型炎症即2型细胞因子，IL-13、IL-4等主要由活化Th2细胞分泌，也可由巨噬细胞、嗜酸性粒细胞等多种细胞分泌，可诱导气道发生炎症反应，进而加重疾病发展[15]。本研究发现，模型组大鼠BALF和血清IL-13、IL-4水平明显增加，异甘草素可降低BALF和血清IL-13、IL-4水平，其剂量越高效果越明显，进一步证实异甘草素可减轻湿热哮喘模型大鼠气道炎症损伤。TLR4/NF-κB通路是较为经典的炎症信号转导途径[16]。本研究发现，模型组大鼠肺组织TLR4、p-NF-κB p65蛋白表达上调，异甘草素呈剂量依赖性降低肺组织TLR4、p-NF-κB p65蛋白表达，提示异甘草素减轻湿热哮喘模型大鼠气道炎症损伤可能与TLR4/NF-κB通路激活有关。

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