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枸杞多糖对心肌梗死大鼠心肌肌钙蛋白I表达及心脏微血管的影响

2024-01-23 52 上传者：管理员

摘要：【目的】探讨枸杞多糖对心肌梗死大鼠的治疗作用及机制。【方法】实验将SD大鼠随机分为正常组、模型组、氯沙坦组、枸杞多糖组。除正常组，其他3组大鼠采用左冠状动脉主干结扎法建立心肌梗死模型。给予相应干预后，采用心脏彩超检查大鼠心功能[左室收缩末期内径（LVSD）、左室舒张末期内径（LVDD）、室间隔（IVS）、左心室劳损（LVS）、左室射血分数（LVEF）]，苏木素-伊红（HE）染色法观察心肌组织病理形态，酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清心肌肌钙蛋白I(c TnI)、一氧化氮（NO）含量，心脏凝胶墨汁染色法测定微血管密度，蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测心肌组织c TnI、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、血小板内皮细胞黏附因子1(PECAM-1)蛋白表达。【结果】与正常组比较，模型组LVSD、LVDD、IVS、LVS均显著升高（P<0.05）,LVEF显著降低（P<0.05）,HE染色可见心肌组织结构破坏，心肌细胞大量坏死，心肌纤维断裂，大量炎症细胞浸润，血清NO含量显著降低（P<0.05）,c TnI含量显著升高（P<0.05），心脏微血管密度显著降低（P<0.05）,c TnI蛋白表达明显升高（P<0.05）,eNOS、PECAM-1蛋白表达显著降低（P<0.05）；与模型组比较，氯沙坦组、枸杞多糖组大鼠以上各指标均得到明显改善（P<0.05），且枸杞多糖组的改善效果均优于氯沙坦组（P<0.05）。【结论】枸杞多糖可通过抑制心肌梗死大鼠cTnI表达，改善心脏微血管损伤，发挥对心脏的保护作用。

关键词：
心肌梗死
心肌肌钙蛋白I(cTnI)
心脏微血管
慢性心力衰竭
枸杞多糖
溶栓
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心肌梗死（myocardial infarction）是临床常见的心血管疾病，是慢性心力衰竭的主要原因，最新调查数据显示，其已经成为全球非传染性疾病患者死亡的首位原因[1]。目前，临床治疗心肌梗死的方法主要为溶栓、冠脉搭桥术或西药等西医治疗方式，但治疗效果并不理想，因此探寻一种有效的治疗方法是临床亟待解决的问题[2]。从中草药中寻找心脏保护的有效药物一直备受关注。枸杞多糖是常见中药枸杞子（为茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果实）的主要药用成分，在降脂降糖、降血压、抗氧化、提高免疫力、抗细胞凋亡等方面发挥重要作用，且已被证实具有保护心脏的作用[3,4]，但其作用机制尚不完全明确。

心肌梗死为急性心肌缺血坏死，心脏微血管损伤是导致其发生、发展的关键因素之一。研究发现，心脏微血管损伤会导致心肌细胞供给不足，进而造成局部急性血栓形成，从而引起心肌梗死[5,6]。改善心脏微血管功能，保护其不受损伤成为治疗心肌梗死的有效切入点。另外，心肌肌钙蛋白I(cTnI）是心肌收缩的重要装置之一。近年来研究[7]发现，cTnI在心肌受损后血清浓度显著升高，且持续时间长，为反映心肌损伤及心肌细胞坏死的重要标志物，特异度及敏感性均较高，被广泛用于临床研究监测。因此，本研究构建心肌梗死大鼠模型，观察枸杞多糖对心肌梗死大鼠cTnI表达及心脏微血管的影响，探讨枸杞多糖的心脏保护作用，以期为其临床治疗提供科学依据，现将研究结果报道如下。

1、材料与方法

1.1 动物

50只SPF级雄性SD大鼠，平均体质量230～290 g，购自江苏华创信诺医药科技有限公司，动物生产许可证号：SCXK（苏）2018-0001，动物使用许可证号：SYXK（苏）2018-0034。实验动物方案已获得河北北方学院附属第一医院伦理协会的批准（批准号：201703-22）。按照《实验动物管理条例》规定进行实验。适应性喂养2周。

1.2药物、试剂与仪器

枸杞多糖（分子式：C11H22O11，分子量：286.31，纯度：99.8%，北京康瑞纳有限公司生产，批号：A2721）；氯沙坦钾片（上海晅科有限公司，批号：XKB3693）。苏木素染液（北京百奥莱博有限公司）；伊红染液（北京博沃尔斯有限公司）；cTnI、一氧化氮（NO）酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（上海臻科有限公司）；兔抗cTnI抗体（深圳市安提有限公司）；兔抗内皮型一氧化氮合酶（eNOS）抗体（武汉益普有限公司）；兔抗血小板内皮细胞黏附因子1(PECAM-1）抗体（深圳豪地华拓有限公司）；兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（深圳豪地华拓有限公司）。MyLab型大小鼠便携式彩色多普勒超声成像仪（上海玉研有限公司）；CX-60型光学显微镜（日本Olympus公司）；HSA-M1812型酶标仪（深圳海思安有限公司）。

1.3 心肌梗死模型构建[2]

随机选取40只大鼠，固定后，腹腔注射1%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉，常规备皮、消毒后，连接好呼吸机、监护仪，然后充分暴露心脏，剪开心包膜，找到左冠状动脉前支并结扎。术毕闭合胸腔，逐层缝合后，皮下注射8 U/kg青霉素，心电图继续监测6 h，若ST段上抬到弓背向上，则视为建模成功。建模过程中3只大鼠死亡，其余37只均建模成功。

1.4 分组与给药

选取建模成功的30只大鼠随机分为模型组、氯沙坦组、枸杞多糖组，每组10只，取剩余10只健康大鼠作为正常组。建模成功后2 h，氯沙坦组灌胃20 mg/kg氯沙坦生理盐水混悬液[4]，对枸杞多糖组灌胃120 mg/kg的枸杞多糖生理盐水混悬液[8]，每日1次，治疗28 d。正常组、模型组同期灌胃同体积生理盐水。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 心肌功能监测

采用心脏彩超检查大鼠心功能，包括左室收缩末期内径（LVSD）、左室舒张末期内径（LVDD）、室间隔（IVS）、左心室劳损（LVS）、左室射血分数（LVEF），各项数值均经计算机处理后获得。

1.5.2 心脏微血管密度检测

心肌功能监测完成后，腹腔注射3%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉处死大鼠，然后由颈静脉将凝胶墨汁染色液注入心脏检测微血管密度。

1.5.3 HE染色法观察心肌组织病理学形态

取各组大鼠心肌组织，制备石蜡切片，常规脱蜡复水后，苏木素染色5 min。蒸馏水洗涤后，1%盐酸酒精分化30 s,0.2%氨水中返蓝2 min，蒸馏水洗涤，伊红染色10 min。去除多余染液，进行脱水、二甲苯透明和中性树胶封片处理，光学显微镜下观察组织病理学。

1.5.4 ELISA法检测血清cTnI、NO含量

取各组大鼠血清，严格按照ELISA试剂盒说明书操作，应用酶标仪于405 nm波长处检测吸光度，并绘制标准曲线，根据标准曲线计算cTnI、NO含量。

1.5.5 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测心肌组织cTnI、eNOS、PECAM-1蛋白表达

取各组大鼠心肌组织，加入400μL RIPA和4μL蛋白酶抑制剂，匀浆机匀浆后，冰盒上裂解40 min，离心并取上清液。二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白浓度，取100μg等量蛋白，经十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）后，半干法将蛋白转至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%牛血清白蛋白（BSA）封闭2 h。洗膜，加入稀释的cTnI、eNOS、PECAM-1(1∶1 000）一抗，4℃摇床孵育过夜。洗膜，加入稀释的二抗（1∶5 000），室温轻摇孵育30 min。化学发光显影、定影、拍照。用Image-Pro Plus 6.0软件分析条带灰度值，计算与GAPDH的比值求得cTnI、eNOS、PECAM-1蛋白相对表达量。

1.6 统计方法

采用GraphPad Prism 8.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 各组大鼠心肌功能相关指标比较

表1结果显示：与正常组比较，模型组LVSD、LVDD、IVS、LVS均显著升高（P<0.05),LVEF显著降低（P<0.05）；与模型组比较，枸杞多糖组、氯沙坦组大鼠LVSD、LVDD、IVS、LVS均显著降低（P<0.05),LVEF显著升高（P<0.05），且枸杞多糖组的改善效果优于氯沙坦组（P<0.05）。

表1 各组大鼠心肌功能相关指标比较

2.2 各组大鼠心肌组织病理形态比较

图1结果显示：正常组心肌组织结构正常，心肌细胞排列清晰整齐，未见明显炎症细胞浸润；模型组心肌组织结构遭到破坏，心肌细胞出现大量坏死，心肌纤维断裂，可见大量炎症细胞浸润；与模型组比较，枸杞多糖组、氯沙坦组病理结构明显改善，胞浆横纹清晰，炎症细胞明显减少。

图1 各组大鼠心肌组织病理形态比较（HE染色，×200)

2.3 各组大鼠血清cTnI、NO含量比较

表2结果显示：与正常组比较，模型组大鼠血清NO含量显著降低（P<0.05),cTnI含量显著升高（P<0.05）；与模型组比较，枸杞多糖组、氯沙坦组血清NO含量显著升高（P<0.05),cTnI含量显著降低（P<0.05），且枸杞多糖组的改善效果优于氯沙坦组（P<0.05）。

表2 各组大鼠血清c TnI、NO含量比较

2.4 各组大鼠心脏微血管密度比较

正常组、模型组、氯沙坦组、枸杞多糖组心脏微血管密度分别为（289.54±16.44)(110.65±5.33)(195.92±9.07)(226.36±12.51)(F=32.730,P<0.001）。与正常组比较，模型组大鼠心脏微血管密度显著降低（P<0.05）；与模型组比较，枸杞多糖组、氯沙坦组心脏微血管密度显著升高（P<0.05），且枸杞多糖组的改善效果优于氯沙坦组（P<0.05）。心脏微血管分布见图2。

图2 各组大鼠微血管分布比较（×200)

2.5 各组大鼠心肌组织cTnI、eNOS、PECAM-1蛋白表达比较

表3、图3结果显示：与正常组比较，模型组心肌组织cTnI蛋白表达水平显著升高（P<0.05),eNOS、PECAM-1蛋白表达水平显著降低（P<0.05）；与模型组比较，枸杞多糖组、氯沙坦组心肌组织cTnI蛋白表达水平显著降低（P<0.05),eNOS、PECAM-1蛋白表达水平显著升高（P<0.05），且枸杞多糖组的改善效果优于氯沙坦组（P<0.05）。

表3 各组大鼠心肌组织c TnI、eNOS、PECAM-1蛋白相对表达量比较

图3 各组大鼠心肌组织cTnI、eNOS、PECAM-1的Western Blot条带

3、讨论

近年来，随着人们生活方式及节奏的日益改变，心肌梗死的患病率呈急剧上升态势，据调查显示，我国每年新增心肌梗死人数高达60万[9]。探求心肌梗死发病的始动因素，防治其发生、发展对提高患者生活质量及生存具有积极而深远的意义[10]。

既往研究发现，枸杞多糖可通过拮抗心肌细胞凋亡、维持线粒体平衡、抗氧化等作用，修复心肌细胞损伤，改善心肌功能，有效治疗大鼠心肌缺血再灌注（I/R）、心肌梗死[4,11,12]。本研究结果亦显示，枸杞多糖可显著改善心肌梗死大鼠心肌功能及心肌组织病理形态，进一步证明其对心肌梗死具有显著疗效。氯沙坦是第一个血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂类药物，其可通过抑制缺血再灌注后心肌细胞凋亡，对心肌梗死起到治疗作用，是临床治疗心肌梗死的常用药物，因此，本研究选其作为阳性对照药物[5,13]。本研究结果表明，枸杞多糖对心肌梗死大鼠心功能的改善效果优于氯沙坦。

cTnI是仅存在心肌内的一种蛋白，定位于肌小节细肌丝上，可参与心肌收缩和舒张的调节，其在正常人中表达很少，但受到如炎症等病理性刺激其水平就会升高[14]。研究[15]发现，在心肌梗死早期cTnI就会释放入血，且表达不会受到血液其他因素的影响，同时cTnI表达异常可能与心肌梗死后心衰密切相关。本研究结果显示，枸杞多糖可显著降低心肌梗死大鼠血清cTnI含量，降低心肌组织cTnI蛋白表达，表明枸杞多糖可能是通过抑制cTnI转录及翻译，抑制cTnI释放入血，进而有效改善心肌舒缩功能，改善心肌损伤，最终有效延缓疾病进展。

心脏微血管在控制组织循环流量、收缩功能、组织代谢、节律控制方面发挥重要作用，其功能正常是心脏微循环正常的前提，心脏微循环损伤是造成心肌梗死发生、发展的潜在因素之一[16]。有研究[17]表明，心肌梗死后心脏微血管密度显著降低，是引起心肌缺血、缺氧、代谢效率降低的主要原因，同时与NO、eNOS一样也是反映心脏微血管损伤的关键指标。而PECAM-1作为免疫球蛋白超家族的重要成员，其在血管生成、信号传导等血管生物学方面具有不可或缺的作用，检测其表达可有效判断心脏微血管数量、功能状态以及与疾病的关系[18]。本研究结果显示，枸杞多糖可显著抑制升高心肌梗死大鼠微血管密度，促进NO、eNOS、PECAM-1表达，这说明枸杞多糖可显著改善心脏微血管损伤，对心脏微血管具有一定保护作用，其可能是通过促进心脏微血管生成，进而改善心肌缺血、缺氧状态，抑制细胞凋亡，最终达到保护心脏微血管，改善疾病症状的目的。

综上所述，枸杞多糖可显著降低心肌梗死大鼠心肌cTnI水平，改善心脏微血管损伤，对心脏具有一定的保护作用，且优于氯沙坦。

参考文献:

[2]张逸飞.麝香通心滴丸调控HIF-1α/VEGF信号通路改善心肌梗死大鼠心肌损伤的机制研究[D].哈尔滨:黑龙江中医药大学,2022.

[3]陈卫英,史有明,何元,等.枸杞多糖对心肌缺血再灌注保护作用机制的研究进展[J].甘肃医药,2023,42(6):497-499,504.

[4]李丽芳,杜娟,薛华,等.枸杞多糖对心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡的影响[J].宁夏医学杂志,2018,40(2):97-99,96.

[6]邢胜.由SETD4调控的静息c-Kit~+细胞在激活后对心脏微血管生成作用的研究[D].杭州:浙江大学,2021.

[8]刘振,韩明磊,崔佳佳,等.氯沙坦对大鼠急性心肌梗死的保护作用及其机制[J].吉林大学学报(医学版),2021,47(6):1397-1406.

[11]孟立立.枸杞多糖通过TGFβ1/Smad3信号通路改善慢性心衰大鼠心肌纤维化[J].中国实验诊断学,2021,25(2):242-247.

[12]周鑫,于睿,林萍.通过激活内皮细胞介导枸杞多糖改善心肌梗死大鼠心肌缺血的研究[J].中华中医药学刊,2021,39(4):219-223,306.

[16]唐湘宇,洪华山,谭华清,等.心肌梗死前后联合运动对大鼠心梗微血管密度和血管内皮细胞生长因子及其受体通路的影响[J].中华物理医学与康复杂志,2020,42(9):775-781.

[17]王自贵,闫强,黄幸.益气化瘀汤对急性心肌梗死再灌注后心肌微血管的保护作用[J].深圳中西医结合杂志,2021,31(13):77-79.

[18]郑丽莉.芎归六君子汤对心肌梗死模型大鼠微血管新生和MMP､TIMP蛋白与基因表达的影响[J].中医学报,2019,34(6):1253-1257.