中草药添加剂含有丰富的活性物质，具有抗菌、抗炎、促进动物生长、提高机体免疫力等作用，且在组织中不易产生药物化合物残留，是提高生产效益的绿色、高效的替抗添加剂。中草药在我国来源广泛，药物资源极其丰富，种类繁多，数量巨大，居世界首位[1]。蒲公英是一种常见的中草药，其主要功能成分有多糖类、黄酮类、三萜类、甾醇类和酚酸类等。近年来，研究人员探索了其多种生物活性，包括降血糖、抗氧化、抗炎[2]、抗肿瘤[3]、保肝[4]和免疫调节作用[5]，可以提高畜禽的生长性能、抗氧化能力和免疫力，改善动物产品品质，提高生产效益。

多糖是从药用植物中分离和纯化得到的一类大分子化合物，是天然的免疫调节剂。多糖提取方法主要有热水浸提取法、酸碱提取法和酶解法等[6]。热水浸提法是提取多糖最常见的方法，该法简单易操作，但只能提取药用植物中水溶性多糖，提取率较低，并且耗时较长。使用酸碱提取法可以提高植物多糖的提取率，但酸碱浓度不适会引起糖苷键断裂，破坏多糖结构。生物酶解法具有特异性分解植物组织的特点，可将细胞壁中的组成成分如纤维素、半纤维素、果胶质等水解，从而使细胞内大分子活性成分迅速释放[7]，具有环保、提取率高等的特点。赵茹等[8]利用纤维素酶辅助提取香菇多糖，测得香菇多糖含量达到5.73%。朱翰林等[9]利用超声辅助酶解提取五味子多糖，多糖得率提高到22.25%。但目前对于植物酶解程度的确定大多数依靠经验判断，具有主观性，无法保证准确性和每批酶解产物的质量标准。若要精准获取酶解品质信息，必须借助化学计量法，植物多糖含量的测定大多使用苯酚-硫酸法，该方法耗时长、试剂危险性高，并对环境有一定污染。因此，寻找一种快速、环保、无损的间接定量检测方法显得尤为重要。

近些年，光谱技术已被广泛用于鉴定和量化天然药物中的活性成分，如核磁共振（NMR）和液相色谱相关的X射线衍射。近红外（NIR）光谱技术综合了光谱技术、化学测定法等多学科的知识，具有快速高效、操作简单、无污染、无损检测和同时测定多组分含量等优点[10]，被广泛应用于农业、食品等行业。Liu等[11]通过NIR光谱结合化学计量学对三七中的活性物质进行定量分析，采用主成分回归（PCR）、支持向量回归（SVR）、PLSR、人工神经网络（ANN）和极限学习机（ELM）等109种多元标定方法构建定量模型，结果发现PLSR是一种综合考虑预测精度、过拟合和效率的最优校准方法，适用于7个掺杂数据集的定量分析。张小斌等[12]利用偏最小二乘回归法建立了基于可见/近红外光谱的水蜜桃糖度无损检测方法。Xie等[13]建立基于全波段和PLSR的近红外模型预测油炸和烘烤马铃薯片中丙烯酰胺含量。魏尊苗等[14]利用近红外光谱技术建立了关于粗脂肪、蛋白质、淀粉和总糖的油莎豆的品质检测。目前，利用近红外技术对茶叶[15]、酿酒[16]的发酵过程中的质量监控也有部分研究，但在发酵饲料制备过程中的品质监控应用较少，并且在过程质量监控的研究中多使用台式近红外仪，台式近红外仪体积大，不方便移动，手持式便于携带、检测方便、可以快速获得实时数据，大大提高效率。针对使用手持式近红外光谱仪对蒲公英酶解过程中的多糖含量变化的快速、无损实时检测的研究还未见报道。

为快速环保的实时监测蒲公英酶解过程中多糖含量的变化，本研究使用果胶酶酶解蒲公英，结合PLSR法以RMSEC、RMSECV、SEC、SEP、R2c、R2p及RPD为评价指标，对最佳光谱预处理方式、最佳波段以及主因子成分数进行筛选，并通过外部验证对模型的准确性进行测试，以期建立酶解蒲公英多糖含量预测的NIR模型，为测定蒲公英酶解过程中多糖的含量提供一种快速的无损分析方式，为精准的预测酶解蒲公英的品质评价提供理论支持。

1、材料与方法

1.1 材料

5种蒲公英（来源为山西省太原市、山西省运城市芮城县、山西省运城市盐湖区、安徽省亳州市、内蒙古呼和浩特市）和麸皮原料均购于市场，果胶酶购于夏盛实业集团有限公司；苯酚、浓硫酸购于天津市汇杭化工科技有限公司，均为分析纯。手持式微型近红外光谱仪（MicroNIR Onsite）购于VIAVI Solutions公司。

1.2 试验方法

1.2.1 蒲公英的酶解

以9∶1(m蒲公英∶m麦麸）的比例将5种不同来源的蒲公英和麸皮分别混合，果胶酶添加量为0.6 g，与27 mL蒸馏水充分混匀。在酶解温度60℃下酶解48 h，每6 h取样，每种每次取3袋，得到125份酶解蒲公英样本。将收集到的酶解蒲公英样品于45℃烘干并粉碎，保存备用。

1.2.2 多糖的测定

分别吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1 mL的葡萄糖标准溶液至10 mL离心管中，补至1.0 mL。按苯酚-硫酸法[17]在吸光度为490 nm下测定吸光度，绘制标准曲线，标准曲线方程为y=3.371 4 x+0.187 6 (R2=0.997 6）。

以1∶16(m料∶V水）的料水比称取酶解蒲公英粉末，热水提取35 min，冷却后离心，取上清。准确吸取0.5 mL上清溶液于10 mL离心管中，加0.5 mL蒸馏水后，按照苯酚-硫酸法进行测定。根据标准曲线方程计算样品溶液的总糖含量。

1.2.3 NIR光谱采集与分析

本研究使用VIAVI Solutions公司手持式近红外光谱仪（MicroNIR Onsite）对酶解蒲公英样品进行近红外光谱扫描。在采集过程中，使样品粉末自然填满样品容器，保证样品表面平整。仪器先以白板作为参比，保持垂直照射并避光检测，以漫反射方式设置光谱扫描波长为1 670 nm，测量单个样品的近红外光谱数据10次，积分时间为50 ms，对光谱值进行均值化处理，从而减少环境差异的影响。通过内部交叉验证的方法，对异常样本剔除并采取逐一回收的方式，剔除时观察模型评价指标，判断是否剔除，以保证最大程度的减小异常样本对模型预测能力的影响，提高构建酶解蒲公英多糖含量预测模型的精准度。

1.2.4 校正集和验证集样品的划分

选择10份样品作为完全外部验证集，供完全外部验证分析。将剩余的115份酶解蒲公英样品以6∶1的比例随机分为校正集（100份）和验证集（15份），校正集用于建立酶解蒲公英多糖含量预测模型，验证集用于检测所建模型的准确性，其中验证集中的多糖含量最高值和最低值均包含于校正集中。

1.2.5 光谱预处理方法筛选

光谱数据预处理是为了提高光谱质量，降低系统噪声，获得可靠、准确、稳定的校准模型。本研究采取一阶导数（FD）、二阶导数（SD）、标准正态变换（SNV）和去趋势（Detrend)4种方法及不同组合的预处理方法，通过比较R2、RMSEC、RMSECV、SEC和SEP值，选择光谱最优预处理方法。

1.2.6 最佳波段的选择

采用MicroNIRTM Pro v3.1软件内的波段筛选程序，根据预处理后的光谱的吸收峰的变化，确定所需要筛选波长的范围。在本研究中将光谱范围分为908～1 000、1 001～1 120、1 124～1 354、1360～1 546、1 552～1 670和全波段908～1 670 nm共6个光谱区间对校正集的酶解蒲公英光谱进行处理，以筛选出建立预测模型的最佳波段。

1.2.7 主成分数的选择

确定最优主成分可以降低维数，不仅减少了创建模型所需的输入数据量，而且加快了模型的运行速度，提高了预测精度[18]。在模型创建过程中，本研究对1～10的主因子数进行筛选，确定模型的最小的RMSECV值时为最优主成分数。

1.2.8 模型建立及验证

本研究使用MicroNIRTM Pro v3.1软件对光谱进行分析，利用PLSR法建立NIR分析模型。以RMSEC、SEC、R2c、RPDc、RMSECV、SEP、R2p和RPDp为指标对模型进行评价。符合要求的模型一般需具有较高的R2，较小的RMSEC及RMSECV和较高的RPD,RPD一般采取阈值分割法进行评价[19]，当RPD>2.5时，模型能够很好地满足预测标准[20]。

1.3 统计分析

使用Origin 2021作图。采用Excel 2019进行数据汇总处理，以SAS 9.2各样本中酶解蒲公英多糖进行统计分析，使用近红外光谱仪自带软件MicroNIRTM Pro v3.1对近红外光谱图进行处理和模型建立。

2、结果与讨论

2.1 酶解蒲公英多糖的化学测定

表1为125份酶解蒲公英多糖含量的化学分析结果。由表可知，校正集的多糖含量范围在110.25～231.32 mg/g，验证集酶解蒲公英多糖含量范围在120.27～225.34 mg/g。研究发现，验证集含量包含于校正集的范围内，即校正集建立模型适用于验证集的样品，并且其变化范围基本上覆盖了蒲公英多糖在不同酶解时间内可能出现的含量，因此该样本可用于建立酶解蒲公英多糖含量的近红外光谱的预测模型。

表1 酶解蒲公英样品中多糖含量的测定  

2.2 近红外原始光谱

在908～1 670 nm波段内采集100个酶解蒲公英样品的近红外光谱（图1）。可见酶解蒲公英在光谱波长范围908～1 670 nm内存在多个吸收峰，其变化趋势未见明显差异但是不重合，在1 205 nm和1 440 nm附近均有吸收峰，分别与C-H基团的二阶倍频和O-H基团的一阶倍频的拉伸振动相关。

图1 酶解蒲公英的原始光谱图  

2.3 光谱预处理方法的选择

样品NIR光谱的噪声信息，基线偏移、漂移等情况均会对光谱分析产生影响，故在光谱分析之前进行预处理是有必要的。本研究通过对4种预处理方式：去趋势（Detrend）、标准正规变换（SNV）、二阶导数（SD）和一阶导数（FD）分别组合，对酶解蒲公英原始光谱进行预处理（表2）。原始光谱经过处理后，模型的预测准确性明显提高，且最佳预处理方法为SNV+Detrend+SD，此时R2c最大为0.903 99,R2p为0.880 3,RMSEC和SEC值分别为8.320和8.362,RMSECV和SEP值分别为9.543和9.585，且校正集和验证集的RPD值均大于2.5,8个评价指标均达到了模型构建的标准。经过预处理后的光谱如图2，酶解蒲公英多糖样品的NIR光谱信息经预处理后吸收峰十分明显，因此选用SNV+Detrend+SD的方法处理后的光谱进行下一步的优化。

2.4 最适波长段筛选

不同吸收峰在NIR光谱代表的物质不同，构建NIR预测模型也应对最适波段进行筛选，以RMSEC、SEC最小，R2、RPD值最大为最佳筛选结果[21]。本研究使用PLSR法进行建模，采取MicroNIRTM Pro v3.1软件内的推荐，结合预处理过后的光谱吸收峰信息，选取在908～1 000、1 001～1 120、1 124～1 354、1 360～1 546、1 552～1 670和全波段908～1 670 nm共6个光谱区间分别对校正集的酶解蒲公英光谱进行处理，并对模型的进行评价。如表3所示，当全光谱区间，即波长范围908～1 670 nm时的R2最大，RMSEC和SEC值最小，分别为8.362 3和8.320 4，且RPD值大于2.5，综上所述，全波段建模效果最好，且明显优于其他任一波长范围，符合模型构建的基本要求。  

表2 光谱预处理方法对模型性能的影响  

图2 酶解蒲公英多糖样本预处理光谱图

2.5 主因子数筛选

通过PLSR建立NIR分析模型时，主因子数也对模型预测准确度有较大影响。主成分数过多，出现过拟合现象。因子数太少，则提取的信息不全面，模型的预测性降低。主因子数对NIR快速预测模型的影响结果如表4所示。当主因子数为2时，RMSECV值最小，故选择建模的最佳因子数为2。

2.6 酶解蒲公英多糖含量的NIR预测模型的建立

通过对校正集和验证集样品的光谱预处理方法、光谱区间和主因子数的筛选，最终构建出酶解蒲公英多糖含量的最优NIR预测模型，该模型的各参数与评价如表5所示。

2.7 模型的外部验证与评价

外部验证是使用除建模数据以外的数据，对所建模型进行验证，可以避免在建模过程中出现的过拟合的情况。使用外部验证集样本检测模型的准确性，结果如图3所示。样品的预测值与实测值均围绕在y=x的参考线附近，说明预测值和实测值间的差异不大。使用SAS软件对预测值与实测值进行显著性分析，结果表明二者差异不显著（P>0.05）。综上，本研究建立的酶解蒲公英的多糖含量预测模型具有良好的准确性，可以满足快速测定的需求。 

表3 建模波段对模型性能的影响 

3、讨论

中草药和药用植物提取物因其独特的生物学特性，包括抑菌、抗氧化、免疫刺激和抗寄生虫活性，已被评价为在生产中替代抗生素的重要来源[22]。但提取物中有效成分含量的测定是一个复杂的过程，并且使用过多的有机溶剂会导致环境污染。因此，寻找一种快速、环保、无损的间接检测方法显得尤为重要。近年来，人们越来越重视近红外光谱技术在含量预测过程中的使用。为提高模型准确性，在模型建立过程中对光谱进行预处理是十分必要的。彭海洋等[23]利用PLSR法建立了快速测定文山三七4种品质指标的近红外光谱模型，其中皂苷、总灰分、酸不溶灰分和水分的最优预处理的方法为MSC、SNV、原始光谱和MSC。潘秀珍等[24]使用NIR光谱技术，建立了连翘叶中5种活性成分的动态定量模型，结果表明总黄酮、总酚、连翘酯苷A、连翘苷和芦丁的最佳预处理方法分别为S-G平滑、S-G平滑、S-G平滑、S-G平滑以及S-G平滑+矢量归一化+MSC。本研究发现使用4种预处理方式的不同组合均可提升模型的预测能力，模型的最佳预处理方式为SNV+Detrend+SD，建立的模型能够满足酶解蒲公英多糖含量的快速测定。最佳波长的选择也是建模过程中一个不可忽视的步骤。本研究对比了不同波长范围对预测模型的影响，发现波长范围在908～1 670 nm时，模型的预测效果最好。可能是因为蒲公英种类不同，许多化学成分通常存在着互相影响的情况，全光谱会包含更全面的信息。除此之外，主因子数也是提升模型准确度的重要指标。周雨枫[25]利用近红外光谱技术对三七的质量进行评价时，以RMSECV作为评价指标，确定了醇溶性浸出物含量的近红外模型最佳因子数为8。本研究通过将波长在908～1 670 nm的光谱进行SNV+Detrend+SD预处理后，以RMSECV的最小值确定了模型的最佳因子数为2。  

表4 主因子数对模型性能的影响    

表5 酶解蒲公英多糖的最优NIR预测模型参数与评价 

图3 酶解蒲公英多糖的测定值与NIR模型预测值的相关性    

表6 模型外部验证与评价 

本研究利用近红外光谱技术建立了快速预测酶解蒲公英中多糖含量的模型，与传统方法相比，更加快速环保，但由于酶解蒲公英样本获取有限，故模型具有一定局限性，为此后续可增加酶解蒲公英样本的多样性，扩大模型的使用范围。

4、结论

本研究以酶解蒲公英多糖为研究对象，利用PLSR法，寻找到最佳酶解蒲公英多糖含量的近红外预测模型，减少了对样品进行复杂处理，缩短了分析时间，大大提高了检测效率，并可在酶解过程中进行实时检测，实现了快速、环保检测，且结果准确，分析高效，为酶解蒲公英质量评价体系的建立提供数据参考。

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文章来源:郑越,李霞,刘娜等.基于NIR定量分析模型快速预测酶解蒲公英中多糖的含量[J].中国农业大学学报,2024,29(04):205-214.