糖尿病是以机体对糖利用效率降低引起的血糖过高为主要特征的代谢性疾病，进而引起蛋白质和脂肪代谢异常，后期会逐渐导致眼、心、脑、肾、足等多器官急慢性并发症。2015—2017年我国18岁及以上人群糖尿患病率为11.2%，达1.56亿人[1]。因此，寻找治疗糖尿病的药物是药物研究的热点。

荭草素和异荭草素是一类黄酮碳苷类化合物，为蓼科植物荭蓼Polygonum orientale L.的主要活性成分，在西番莲、决明、黄荆、竹叶、满天星、麻花艽等中药材中也存在。近年来的药理学研究表明，荭草具有丰富的药理活性，其主要活性成分荭草素和异荭草素具有心血管保护、抗衰老、抗肿瘤、抗炎、调血糖等药理作用[2,3,4]。荭草素和异荭草素可以改善脂肪细胞中的葡萄糖代谢，维持肝细胞的底物利用率来改善胰岛素抵抗现象已被证实[5]，但关于其降血糖的靶点及体外活性研究较少。

本研究拟通过虚拟分子对接筛选中药荭草中黄酮碳苷类有效成分荭草素和异荭草素可能的降血糖靶点，并对关键靶点进行体外活性测试，从而揭示荭草素和异荭草素降血糖作用及其作用机制。

1、材料

1.1 药品及主要试剂

荭草素（成都曼思特化学制剂有限公司，质量分数≥98%，批号20171105）；异荭草素（成都曼思特化学制剂有限公司，质量分数≥98%，批号20171105）；荧光脱氧葡萄糖（1-NBDG，药明康德新药开发有限公司，批号ET4099-7-P1）；达格列净（上海瀚香生物科技有限公司，批号2014102202);4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷（PNPG，成都华娜化学制剂有限公司，批号20171026）；阿卡波糖（成都艾娜华化学制剂有限公司，批号20170828);DMEM培养基（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号GP21110161645）；胰蛋白酶（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号CR2112015）；磷酸缓冲液（武汉普诺赛生命科技有限公司，批号WH0022A071）；氯化胆碱、氯化钾、氯化镁、氯化钙（天津市天力化学试剂有限公司）。

1.2 细胞

稳定过表达钠–葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2）的HEK293（人胚胎肾上皮细胞），稳定高表达蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B）的293T细胞（人胚肾细胞），由中国医学科学院协和细胞中心提供。

1.3 仪器

Radiance 2100 CLSM激光共聚焦扫描显微镜（Bio-Rad公司），MCO-15AC CO2培养箱（Sanyo公司），Enspire荧光酶标仪（Perkinelmer公司）。

2、实验方法

2.1 分子对接

从www.rcsb.org网站依次下载糖尿病相关靶点在Schrödinger软件中对受体结构用Protein Preparation Wizard模块分别进行加氢、加电荷、去除结晶水等处理，并采用Glide模以原配体为中心（GPR40和SGLT2以文献报道活性位点残基为中心）生成格点文件；采用Lig Prep模块对配体进行处理，采用Epik方法生成p H(7±2）的所有可能构象，采用Glide模块以标准精度进行分子对接，得出分子对接结果，并计算阳性对照物与荭草素/异荭草素的分子对接得分差异度。

得分差异度=（阳性对照物得分-荭草素/异荭草素对接得分）/阳性对照物得分

2.2 体外抑制SGLT2活性实验

本研究采用稳定过表达SGLT2的人胚肾细胞（HEK293）模型，并以1-NBDG为底物进行葡萄糖转运实验，采用文献报道[6]的方法初步评价化合物对HEK293细胞SGLT2摄取功能的抑制强度。

将浓度为3×108个/L的过表达SGLT2的HEK293细胞按100μL/孔细胞铺板，90%融合后，采用低糖无血清DMEM培养基处理2 h后，用非特异性摄取缓冲液（Na+-free buffer）/Na+依赖性摄取缓冲液（Na+-buffer）清洗1遍，再加入含有1-NBDG(100μmol/L）的摄取液进行葡萄糖摄取。

在上述培养板中按50μL/孔依次加入荭草素、异荭草素和达格列净（3个平行浓度）溶液，浓度均为1×10-5 mol/L，在37℃下摄取4 h；然后加入含有0.5 mmol/L根皮苷的摄取缓冲液使反应停止；在荧光显微镜下观察细胞内荧光强度。将0.1 mol/L Na OH裂解细胞转移至底部透明的96孔黑板中，采用荧光酶标仪检测细胞内1-NBDG含量（激发波长/发射波长：485 nm/535 nm）。采用荧光酶标仪检测细胞裂解液的荧光强度，结果以荧光强度/蛋白含量来表示。

2.3 体外抑制α-葡萄糖苷酶活性实验

采用文献报道的方法[7,8]评价荭草素和异荭草素对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。实验将分为对照组、荭草素（100μmol/L）组、异荭草素（100μmol/L）组、阿卡波糖（100μmol/L）组，在160μL的96孔板开展，每组3个平行孔。将20μL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（p H 7.0）、20μL底物溶液（2.5 mmol/L p NPG溶于0.1 mol/L磷酸缓冲液）和20μL 100μmol/L待测药物依次加入孔中，混匀，在37℃水浴中振荡10 min后，再加入20μL α-葡萄糖苷酶溶液（在含有0.2%BSA的0.01 mol/L磷酸缓冲液中加入0.2U/m L α-葡萄糖苷酶，溶解），充分混匀，然后放入37℃水浴中反应20 min。结束后加入80μL 0.2mol/L碳酸钠溶液中止反应，采用酶标仪在405 nm处测定其吸光度（A），最后根据公式计算出各样品的抑制率。

抑制率=1-(A受试-A空白）/（A对照-A空白）

2.4 体外抑制PTP1B活性实验

采用文献报道的方法[9]测定荭草素和异荭草素对PTP1B的抑制活性。本实验分为对照组、荭草素（100μmol/L）组、异荭草素（100μmol/L）组、阳性对照化合物V[10](100μmol/L）组，PTP1B酶稀释至0.5 ng/μL待用，以p NPP作为PTP1B的底物，每组3个平行孔。在160μL的96孔板中，将10μL待测物与5μL PTP1B于室温下共孵5 min，后依次加入35μL反应液（含有50 mmol/L HEPES、5mmol/L DTT、150 mmol/L Na Cl、2 mmol/L EDTA）和50μL p NPP溶液（2 mmol/L,p H 7.0），在30℃下孵育10 min，加入25μL 3 mol/L氢氧化钠溶液终止酶反应。水解产物对硝基苯酚钠在405 nm处有很强的光吸收，采用酶标仪测定405 nm处的A，根据公式计算出各样品的抑制率。

抑制率=1-(A受试-A空白）/（A对照-A空白）

2.5 统计学分析

数据采用SPSS 19.0软件进行统计分析，结果均以±s表示。

3、结果

3.1 荭草素和异荭草素与糖尿病相关靶点的分子对接结果

从www.rcsb.org网站下载糖尿病相关靶点的晶体结构，见表1。荭草素和阳性对照物与糖尿病靶点的分子对接结果以结合能表示见表2，其中SGLT2、α-葡萄糖苷酶与阳性对照物达格列净和阿卡波糖的分子对接结果分别-9.79 kcal/mol(1 cal=4.4 J）、-5.58 kcal/mol；而荭草素与SGLT2和α-葡萄糖苷酶对接得分分别为-9.32 kcal/mol、-5.67kcal/mol，其与阳性对照物得分差异度分别为4.80%、1.59%，分子对接结果差异度小。其中荭草素与SGLT2中的Thr153、Trq291、Ser460形成4个氢键，与α-葡萄糖苷酶中的Asp282、Asp518、Arg600、Asp616形成6个氢键。

异荭草素和阳性对照物与糖尿病靶点的分子对接结果见表3，异荭草素与SGLT2中的Asn75、Aer460、Ser400形成4个氢键，对接结果为-8.63kcal/mol，其与阳性对照物达格列净对接得分相比其差异度为11.84%；与α-葡萄糖苷酶中的Asp282、Arg281、Asp404、Phe525、Asp616形成5个氢键，对接结果为-5.34 kcal/mol，比阳性对照药阿卡波糖的-5.58 kcal/mol略弱，但二者的差异度为仅4.30%。异荭草素与其他靶点的分子对接普遍较弱，而与PTP1B的分子对接结果仅为-4.93 kcal/mol，其与阳性对照物化合物902的差异度达46.88%。

表1 糖尿病相关靶点及PDB编号 

由表2、3可知，荭草素和异荭草素在糖尿病靶标中，对α-葡萄糖苷酶有较强的结合作用，其次对SGLT2也具有较好的结合能力，但对PTP1B的结合能力很弱。因此。荭草素和异荭草素的降血糖作用可能是通过抑制双靶点α-葡萄糖苷酶和SGLT2发挥。

3.2 荭草素和异荭草素抑制α-葡萄糖苷酶、SGLT2、PTP1B活性

体外活性测试结果表明，在100μmol/L时荭草素对α-葡萄糖苷酶的抑制率为（16.7±5.8）%，异荭草素对α-葡萄糖苷酶的抑制率为（11.8±3.8）%，同浓度的阳性对照药阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率为（63.7±5.8）%；荭草素对SGLT2蛋白的抑制率为（15.4±1.2）%，异荭草素对SGLT2抑制率为（9.4±1.1）%，而同浓度的阳性对照药达格列净对SGLT2的抑制率为（92.7±8.8）%；荭草素对PTP1B的抑制率仅为（3.0±0.5）%，异荭草素对PTP1B的抑制率为（-3.8±0.6）%，同浓度的阳性对照药V对PTP1B的抑制率为（73.4±8.3）%，见表4。

4、讨论

糖尿病的药物治疗靶点多，药物多，但糖尿病发病率高，严重影响人们的身心健康和生活质量，且许多治疗糖尿病的药品商品化严重，成本高，且药物之间的相互作用与不良反应较多[13]，而传统中药在治疗糖尿病时可能耐受性较强，不良反应较少，因此从天然药物中寻求治疗糖尿病的药物研究一直是药学研究的热点。SGLT2抑制剂和α-葡萄糖苷酶抑制剂均是良好的降血糖药物[14,15,16]，但是兼有抑制SGLT2和α-葡萄糖苷酶的药物报道较少。  

表2 荭草素与糖尿病靶点的分子对接结果   

表3 异荭草素与糖尿病靶点的分子对接结果  

表4 荭草素、异荭草素对SGLT2、α-glucosidase、PTP1B蛋白的抑制率的影响  

在靶点筛选中发现，荭草素和异荭草素对α-葡萄糖苷酶具有较好的结合作用，其分子对接得分与阳性对照药阿卡波糖基本接近，但其细胞实验发现荭草素和异荭草素在100μmol/L时对α-葡萄糖苷酶的抑制率分别为（16.7±5.8）%、（11.8±3.8）%，均对α-葡萄糖苷酶表现出温和的抑制作用；荭草素和异荭草素对SGLT2也表现出较好的结合作用，其分子对接得分与阳性对照药达格列净的差异度分别为4.80%、11.84%，但细胞实验显示二者对SGLT2的抑制率分别为（15.4±1.2）%、（9.4±1.1）%，均有一定的抑制活性；在PTP1B的研究中，荭草素和异荭草素在分子对接均表现出对该蛋白弱的结合作用，在细胞实验中几乎无抑制作用。因此，荭草素和异荭草素可同时抑制α-葡萄糖苷酶和SGLT2 2个蛋白，呈现出很好的双靶点降血糖作用，是潜在的一类具有SGLT2和α-葡萄糖苷酶双靶点抑制的化合物。

对比荭草素和异荭草素，可以发现，荭草素对α-葡萄糖苷酶和SGLT2 2个蛋白表现出较强的抑制作用。在分子对接中，荭草素与阿卡波糖的分子对接差异度为1.59%，优于异荭草素与阿卡波糖分子对接差异度4.30%，荭草素与达格列净的分子对接差异度为4.80%，也优于异荭草素与达格列净分子对接差异度11.84%；在细胞实验中，荭草素在100μmol/L时对α-葡萄糖苷酶SGLT2蛋白的抑制率分别为（16.7±5.8）%、（15.4±1.2）%，均优于异荭草素对α-葡萄糖苷酶SGLT2蛋白抑制活性的（11.8±3.8）%、（9.4±1.1）%。因此，荭草素比异荭草素具有更好的靶点抑制活性，可能比异荭草素具有更好的降血糖作用。

综上，荭草素和异荭草素对SGLT2和α-糖苷酶均具有一定的抑制活性，对PTP1B基本没有抑制作用，且荭草素的体外活性略强于异荭草素。荭草素有可能作为一类具有双靶点作用的降血糖先导化合物，对其开展进一步研究，拓展荭草素在降血糖方面的应用，对新型降血糖药物的研发具有一定意义。

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基金资助:陕西省自然科学基础研究计划(2019JQ-401);陕西中医药大学校级科研课题(2020GP32);

文章来源:赵晨颖,韩雪,贺一凡等.虚拟筛选荭草素和异荭草素降血糖靶点和体外活性评价[J].现代药物与临床,2024,39(02):304-308.