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枸杞子潜在燥性反应对小鼠特性表征的影响

2024-03-26 60 上传者：管理员

摘要：目的明确不同剂量枸杞子与小鼠燥性反应特性表征的关系及其对生理生化指标变化的影响。方法将40只雄性老年小鼠随机分为空白组，枸杞子高、低剂量组，并以经典热性药方干姜、附子、肉桂作为阳性药组，连续给药14 d并记录小鼠一般体征变化，利用苏木素-伊红(HE)染色和免疫组化检测脾脏组织的病理学改变。同时，检测血清中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)、丙二醛(MDA)和过氧化氢酶(CAT)活力及相关炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6和CC家族趋化因子配体(CCL)2的表达变化。结果与空白组比，热性药方和高剂量枸杞子均能使小鼠出现体质量下降、摄食量减少、饮水量增多和毛发干枯等燥性反应特性的症状。枸杞子高剂量组出现脾脏异常增大、脾脏指数升高的变化，通过HE染色及免疫组化观察发现其脾脏结构发生显著变化，红髓与白髓界限模糊，脾小体结构不清晰且有炎性细胞浸润等现象。在病理学改变基础上，高剂量枸杞子和热性药方均能够显著促进TNF-α、IL-1β、IL-6和CCL2因子表达，同时显著降低CAT、SOD、GSH-px活性并显著提升MDA活性(P<0.05)。结论枸杞子高剂量组能够引起氧化应激损伤和炎症因子表达失衡，这可能是过量服用枸杞子伴随着燥性反应症状发生的原因之一。

关键词：
全身性反应症候
枸杞子
氧化应激
炎症因子
燥性反应
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燥性反应常出现口腔溃疡、牙龈及咽喉肿痛、眼睛红肿干涩、流鼻血、尿赤、便干等一系列症状，时常伴有全身性反应症候[1,2]。现有研究表明，引起燥性反应的生物机制与体内炎症反应、氧化应激、激素调节、能量代谢等密切相关[3,4,5,6],这一系列生理生化反应的失衡造成了人体亚健康状态[4,5,6]。导致燥性反应的因素有很多，如环境、饮食、精神状态等，而其中最关键的因素是体质。老年人体质逐渐衰弱，身体代谢能力、抗应激能力均不足，体内微环境长期处于炎症状态或自由基过剩，更容易产生燥性反应[7,8]。据《本草纲目》记载，枸杞子“能补肾、润肺、生精、益气”,其作为药食同源的滋补佳品深受民众喜爱[6],特别是老年群体多喜用枸杞子泡水代茶或煲汤等。但确有部分人群服用枸杞子后出现燥性反应症状，表现为流鼻血、口干、咽喉肿胀、眼睛红胀不舒服等症状，极大地制约了枸杞子的广泛应用[9,10]。目前，服用枸杞子发生燥性反应现象的描述尚不完全。为更好认识枸杞子产生燥性反应的实质，本研究选择最具代表性的干姜、肉桂、附子热性药方剂作为诱发燥性反应的阳性对照药，其药性辛热燥烈，长期服用会诱发燥性反应症状[11]。本研文拟分析枸杞子潜在燥性反应对小鼠特性表征的影响。

1、材料与方法

1.1 材料

仪器：真空冻干机，SCANVAC,沈阳基因有限公司；离心机，Centrifuge 5810 R,德国Eppendorf AG;酶标仪，Infinite M200 PRO,澳大利亚TECAN;石蜡包埋机，JB-P5,武汉俊杰电子有限公司；组织切片机，RM2016,上海徕卡仪器有限公司；光学显微镜，M8,德国PreciPoint。试剂：枸杞子、肉桂、附子、干姜购于北京同仁大药房；酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购于江苏酶免实业有限公司；4%多聚甲醛、苏木素-伊红(HE)染色试剂盒、Triton-X-100购于北京索莱宝科技有限公司；羊血清购于美国Thermo Scientific; CD68一抗和二抗购于武汉Proteintech。动物：雄性10月龄C57BL/6小鼠购自沈阳长生生物技术有限公司，饲养于SPF级动物房，恒温(25±2)℃,恒湿(55±5)%,光照周期12 h, 自由摄取食水，适应期7 d。本研究所有动物实验操作符合长春中医药大学动物伦理委员会规定。

1.2 枸杞子提取物的制备

将100 g枸杞子以1 L水煮沸1 h, 将煎液倒出，再加1 L水煮沸1 h, 将两次煎液合并，以8 000 r/min离心，弃沉淀，将提取物制成冻干粉，称量后置于干燥处备用。

1.3 热性药煎液的制备

取肉桂、附子、干姜各30 g, 加水900 ml, 同1.2中方法制备。

1.4 动物实验

将40只小鼠随机分为空白组、热性药方组(1.5 g/kg)、枸杞低剂量组(1.8 g/kg)、枸杞高剂量组(3.6 g/kg),每组10只，每天上午灌胃给药，空白组给予等量盐水。每天灌胃1次，称体质量、食物重量、饮水量，测量肛温，连续14 d。第15天处死小鼠，取血液与组织样本。

1.5 粪便含水量

收集各组小鼠新鲜粪便，称量等量新鲜粪便，经冻干，称量冻干粪便重量，含水量=新鲜粪便重量-冻干粪便重量。

1.6 生化指标检测

各组血液在37 ℃放置30 min, 3 000 r/min离心10 min取血清。按照ELISA试剂盒说明书步骤，于450 nm波长处，分别检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β、IL-6、CC家族趋化因子配体(CCL)2、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)。

1.7 脾脏指数

称量各组脾脏重量，取与第15天各自体质量的比值，脾脏指数=脾质量/第15天体质量×100%。

1.8 HE染色

将脾组织放入4%多聚甲醛，浸泡24 h, 然后经酒精脱水、二甲苯透明化、石蜡包埋后，制成5 μm厚的冠状切片，再经二甲苯与酒精脱水，然后进行苏木素染色，氨水返蓝，伊红染色，最后风干封片，光学显微镜下观察组织结构。

1.9 免疫组化

将脱水后的石蜡切片用0.3% Triton-X-100孵育30 min, 用5%羊血清封闭2 h, 然后在4 ℃孵育CD68一抗过夜，第2天室温孵育二抗2 h, 最后光学显微镜下观察染色结果。

1.10 统计学方法

采用SPSS19.0软件进行ANOVA检验。

2、结果

2.1 枸杞子提取物引起小鼠燥性反应体征变化

从小鼠形态上观察，空白组毛发顺滑油亮，热性药方组毛发干燥，枸杞低剂量组毛发未见异常，然而枸杞高剂量组干燥。与空白组比较，热性药方组、枸杞子高剂量组体质量显著下降，饮水量显著升高，热性药方组进食量显著降低(P<0.05);体温略有升高但无统计学差异(P>0.05)。各组粪便含水量均无显著差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组燥性反应体征及脾脏CD68表达、脾脏指数比较

2.2 枸杞子提取物引起小鼠脾脏的病理变化

空白组脾脏红髓与白髓界限分明，脾小体清晰完整，无巨噬细胞浸润，脾窦无异常扩张，细胞分布均匀。热性药方组脾血窦增多，细胞排列略散乱，但红髓与白髓较分明，无巨噬细胞浸润，与空白组相比无显著差别。枸杞低剂量组无明显异常，与空白组相比红细胞更充盈。枸杞高剂量组脾脏红髓与白髓界限模糊，脾小体轮廓不清晰，有巨噬细胞浸润(黑色箭头),有几处血窦扩张(黄色箭头)。见图1。空白组、热性药方组与枸杞低剂量组脾脏中单核/巨噬细胞标志物CD68表达量很低，而枸杞高剂量组较空白组显著升高(P<0.05)。枸杞高剂量组脾脏指数也显著高于空白组(P<0.05),阳性药方组、低剂量组与空白组无统计学差异(P>0.05)。见表1。

图1 各组脾脏病理

2.3 枸杞子提取物引起小鼠体内炎症反应

热性药方组和枸杞高剂量组TNF-α、IL-1β、IL-6及CCL2水平显著高于空白组(P<0.05);枸杞低剂量组TNF-α和IL-1β水平显著高于空白组(P>0.05),见表2。

2.4 枸杞子提取物引起小鼠体内氧化应激损伤

与空白组相比，热性药方组及枸杞高剂量组SOD、CAT及GSH-px水平显著降低，MDA水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05);枸杞低剂量组CAT水平显著降低(P>0.05),见表2。

表2 各组炎症因子及氧化应激反应指标比较

3、讨论

枸杞子作为补品深受老年人喜爱，但过量摄入可能会出现燥性反应症状，如口干咽痛、眼睛肿胀、头疼等[9]。本研究显示，给予老年小鼠低剂量(药典规定剂量)和高剂量(2倍药典规定剂量)枸杞子提取物，与经典热性药方体征相似。结合现代医学理论，燥性反应是一种机体稳态失衡的表现，然而老年人机体很容易因为饮食不当而产生稳态失衡[3,8]。机体的稳态是由体内各种生理生化反应及各个组织相互维系，任何一个器官或生理反应的异常，都会导致燥性反应证候[4,6]。脾是人体重要的免疫器官，脾脏组织的变化可直接影响机体免疫功能，脾胃不和者过量食用枸杞子容易燥性反应[9,12]。

炎症反应是机体进行自我保护的最重要反应之一，当受到异物入侵，多种炎症因子、趋化因子水平升高，参与抵抗外物侵袭[13]。当机体内自由基过多，氧化反应超过抗氧化作用会导致氧化应激，抗氧化酶类活性降低，机体产生大量氧化中间产物，参与多种疾病过程，还促进牙龈肿痛、大便干结等燥性反应症状[14]。

枸杞子虽滋补，但过量食用会导致脾湿加重，滋生内火，老年人阴液不足者更易引发燥性反应。依据现代医学理论，过量食用枸杞子引发炎症反应和氧化应激，然而老年人抵抗应激能力下降，易诱发“燥性反应”证候。本研究通过对小鼠体征变化、脾组织病理变化的观察及炎症反应、氧化应激检测，首次阐释了过量食用枸杞子引起燥性反应的作用机理。然而，燥性反应的生物内涵十分复杂，更深层的作用机制还有待进一步研究。

参考文献:

[1]何淼泉,鲍玺,温成平.火热证候的临床特征[J].中华中医药杂志,2013;28(3):791-2.

[2]何汝帮,杨安平.“上火”证发病机理的研究综述[J].亚太传统医药,2008;4(12):144-5.

[4]何蓉蓉,栗原博.论“上火”与应激反应[J].世界科学技术——中医药现代化,2008;10(5):37-41.

[5]苏鑫,孙大中.“上火”与应激反应相关性探析[J].中华中医药杂志,2015;30(1):32-4.

[6]李思敏,包洁,汪琴静,等.氧化应激与实热的相关性研[J].世界中医药,2017;12(12):2872-5.

[8]吴金飞.“上火”的舌象与症状特征研究[D].北京:北京中医药大学,2008.

[9]何莉莎,赵林华,叶茹,等.枸杞子与“上火”的关系问卷调查[J].中医杂志,2017;58(2):111-4.

[10]沈学英,蒋亚生.枸杞子药理研究进展[J].时珍国医国药,1999;10(10):798-9.

[11]季巾君,焦一凤,陈仙英,等.干姜附子肉桂汤诱导口腔溃疡的机制研究[J].浙江中医药大学学报,2018;42(10):775-81.

[12]段雨婷,张越,黄佳静,等.茯苓不同部位水提物对脾虚模型小鼠健脾作用的研究[J].安徽中医药大学学报,2023;42(2):68-73.

[13]张漪婷,蒋福升,窦晓兵.上火与炎症相关性探析[J].浙江中医药大学学报,2019;43(2):152-4.