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青钱柳对链脲佐菌素诱导大鼠胰岛细胞损伤的保护作用

2024-05-04 58 上传者：管理员

摘要：目的探讨青钱柳对链脲佐菌素(STZ)诱导的大鼠胰岛细胞损伤的保护作用。方法 60只大鼠，随机选取10只为正常组，其余1次性腹腔注射STZ建立大鼠糖尿病模型后随机分为模型组，青钱柳低、中、高剂量组和罗格列酮药物组。持续给药4 w,测定空腹血糖值、流式细胞仪测定胰岛细胞凋亡情况、荧光分光光度计法测定半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3的含量及Western印迹法测定B细胞淋巴瘤(Bcl)-2相关X蛋白(Bax)和Bcl-2蛋白表达。结果青钱柳可显著改善STZ诱导的大鼠糖尿病症状，抑制胰岛细胞的凋亡及Caspase-3和Bax蛋白表达，促进Bcl-2蛋白表达，与模型组比较具有显著性差异(P<0.05,P<0.01)。结论青钱柳具有抗STZ诱导的大鼠胰岛细胞凋亡作用，其主要作用机制与抑制凋亡相关蛋白表达有关。

关键词：
STZ
胰岛细胞损伤
链脲佐菌素
青钱柳
高血糖
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糖尿病是当今社会危害人类健康，影响人的生活质量和寿命的主要疾病之一，其发病具体原因复杂，仍不明确，目前认为胰岛β细胞凋亡是导致糖尿病发生发展的重要因素[1,2],因此抑制胰岛细胞凋亡是治疗糖尿病的重要途径。青钱柳系双子叶胡桃科青钱柳属植物，在我国南方地区如江西、湖南、广东、广西等地多见，民间多用青钱柳叶作甜茶食用，具有一定的保健作用[3,4]。现代药理研究表明其主要含有多糖、黄酮类活性成分，具有降血糖、降血压等作用[5,6]。本研究观察青钱柳提取物对抗链脲佐菌(STZ)素诱导大鼠胰岛细胞凋亡的作用，为临床开发使用提供理论依据。

1、材料与方法

1.1 青钱柳提取物的制备

青钱柳叶采自江西省上饶市中贸药业青钱柳种植基地，经江西医学高等专科学校中药教研室鉴定，清洗自然晾干，粉碎，按照料药比1∶10加入蒸馏水蒸馏提取得到青钱柳提取物。

1.2 主要试剂和仪器

STZ购自美国Sigma公司，大鼠血糖试剂盒购自南京建成生物研究所，罗格列酮片，规格4 mg/片(成都恒瑞制药有限公司，生产批号191225),流式细胞仪、荧光分光度计。

1.3 实验动物

SD大鼠60只，雌雄各半，平均体质量(220±20)g,购自南昌大学医学院动物实验中心。

1.4 实验分组与给药方法

正常喂养1 w后，正常组腹腔注射柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液50 mg/kg,其余鼠一次性腹腔注射STZ 50 mg/kg, 24 h后的血糖值高于15 mmol/L,为糖尿病模型合格，建模成功大鼠随机分为模型组，青钱柳低、中、高剂量(50、100、150 mg/kg)组，罗格列酮药物组(10 mg/kg),各组每天给药1次，连续给药4 w。模型组和正常组给予等量生理盐水。

1.5 试剂盒法测定大鼠空腹血糖值

于第4周最后1次给药后自由喂水，禁食12 h,腹部清洁、酒精消毒后切开皮肤，经腹主动脉取血，选择4℃离心2 500 r/min×5 min分离血清，测定各组血糖值。

1.6 流式细胞仪测定胰岛细胞损伤

大鼠经腹主动脉取血后迅速处死，取新鲜胰腺组织，37℃水浴上用0.05%胰酶消化分散得到单细胞混悬后，接种于96孔板，调整细胞密度为5×105～1×106/ml。采用膜联蛋白(Annexin)Ⅴ-碘化丙啶(PI)双染色法检测细胞凋亡，取200μl细胞悬液，加10μl Annexin-Ⅴ-异硫氰荧光素(FITC)和5μl PI混匀后室温避光孵育15 min,最后加磷酸盐缓冲液(PBS)保持终体积300μl,用流式细胞仪分析，计算细胞凋亡率。

1.7 荧光分光光度计法测定半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3含量

取大鼠新鲜胰腺组织洗净后用手术剪切割成0.5 mm3左右大小碎块，每100 ml组织中加60μl裂解液冰浴30 min, 4℃离心，10 000 r/min×15 min,取上清液于EP管内，运用考马斯亮蓝法测定总蛋白浓度。取50μg的蛋白加入20μl测定缓冲液[含20 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)液pH7.5、2 mmol/L双对氯苯基三氯乙烷、10%甘油]和5μl的Caspase-3四肽荧光底物20μmol/L,于37℃避光孵育2 h。荧光分光光度计选择吸收波长380 nm、激发波长450 nm,测定Caspase-3的结果，用与7-氨基，3-氟甲基，香豆素(AFC)空白对照表示。

1.8 Western印迹法测定B细胞淋巴瘤(Bcl)-2相关X蛋白(Bax)、Bcl-2

取等量蛋白用8%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶进行变性梯度电泳，分别加兔抗鼠一抗Bax、Bcl-2和β-actin, 4℃过夜及辣根过氧化酶标记的二抗孵育1 h后化学发光法显影X胶片显示条带，分析蛋白表达。

1.9 统计学方法

采用SPSS20.0软件进行t检验。

2、结果

2.1 青钱柳提取物对糖尿病大鼠体质量和血糖的影响

模型组体质量下降，血糖升高，与正常组比较有极显著差异(P<0.01);青钱柳高剂量组和罗格列酮药物组体质量和血糖与模型组比较，具有显著差异(P<0.05,P<0.01)。见表1。

2.2 青钱柳提取物对糖尿病大鼠胰岛细胞损伤的作用

与正常组比较，模型组胰岛细胞凋亡率明显升高(P<0.01)。青钱柳中、高剂量组和罗格列酮药物组和模型组比较凋亡率显著降低(P<0.05,P<0.01)。见表1。

2.3 青钱柳提取物对糖尿病大鼠胰腺组织中Caspase-3的作用

模型组Caspase-3含量较正常组明显升高(P<0.01),青钱柳高剂量组和罗格列酮组Caspase-3含量显著下降(P<0.01)。见表1。

2.4 青钱柳提取物对糖尿病大鼠胰岛细胞中Bax、Bcl-2的影响

与正常组比较，模型组Bax蛋白表达含量显著升高，Bcl-2表达显著下降(P<0.01)。青钱柳中、高剂量组及罗格列酮组Bax降低，Bcl-2升高，差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。见表1、图1。

表1各组体质量、血糖、胰岛细胞凋亡率、Caspase-3、Bax、Bcl-2表达比较

图1各组胰腺组织Bcl-2、Bax蛋白表达

3、讨论

研究表明，长期高糖作用下，胰岛细胞损伤后出现调控细胞凋亡机制失衡，正常分泌胰岛素的β细胞数量减少，是糖尿病的主要机制[7]。细胞凋亡是在多种基因调控下出现的细胞程序性死亡过程，其中Bax为促凋亡基因，能够破坏线粒体渗透性，激活Caspase-3,促进细胞凋亡。Bcl-2为抑凋亡基因，通过抑制细胞凋亡，延长细胞生存，参与多种疾病发生，而且Bcl-2还间接抑制促凋亡蛋白Caspase-3激活。因此Bax/Bcl-2能很好地反映Bax和Bcl-2对细胞凋亡的调控作用[8,9]。研究表明，当机体长期处于高血糖刺激下，胰岛细胞内Bax多聚化后诱发细胞凋亡[10]。本实验结果证实在高糖状态下，胰岛细胞Bax蛋白表达水平显著提高，而拮抗Bax具有抗凋亡作用的Bcl-2的表达出现下降。

Caspase家族是一切凋亡信号转导的共同通路，各种Caspase层层激活，最终引发细胞凋亡，其中Caspase-3是主要的效应Caspase,是凋亡发生的标志酶[11]。在细胞凋亡中，通过测定Caspase-3能很好地反映细胞凋亡情况[12],本研究提示青钱柳有抑制胰岛细胞凋亡的作用。

综上所述，青钱柳提取物可显著降低糖尿病大鼠高血糖作用，其可能机制为上调Bcl-2,下调Bax和Caspase-3的表达，从而抑制细胞凋亡。

参考文献:

[2]中华医学会糖尿病学分会.中国2型糖尿病防治指南(2017年版)[J].中华糖尿病杂志,2018;10(1):4-67.

[3]中华本草编委会.中华本草.第2卷[M].上海:上海科学技术出版社,1999:370.

[5]彭攸灵,彭丽英,杨先国,等.青钱柳老叶和嫩叶化学成分液质分析及5种成分含量的比较[J].中国实验方剂学杂志,2018;24(19):85-91.

基金资助:江西省教育厅科技项目(No.GJJ213408);

文章来源:程畅河,刘小龙,赖宇.青钱柳对链脲佐菌素诱导大鼠胰岛细胞损伤的保护作用[J].中国老年学杂志,2024,44(08):1952-1954.