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高效液相色谱法测定鱼腥草芩蓝合剂中黄芩素

2024-05-15 96 上传者：管理员

摘要：本文建立了高效液相色谱法测定鱼腥草芩蓝合剂中黄芩素含量的方法。色谱柱为SHIMSEN Ankylo C18(4.6 mm×250 mm,5μm)，柱温40℃，紫外检测波长275 nm，进样量10μL，流动相为乙腈-0.1%磷酸，等度洗脱(32∶68)，洗脱时间为60 min(黄芩素对照品溶液洗脱时间为30 min)，流速为1.0 m L/min。共测定7批鱼腥草芩蓝合剂中黄芩素的含量。黄芩素在0.0065～0.1294 mg/m L范围内具有良好线性关系(r=1.0000)，平均回收率为99.29%(RSD=1.16%)。7批鱼腥草芩蓝合剂中黄芩素的质量浓度为0.0083～0.0342 mg/m L-1。该方法准确可靠，适用于鱼腥草芩蓝合剂中黄芩素含量的测定。

关键词：
中药制剂
含量测定
高效液相色谱法
鱼腥草芩蓝合剂
黄芩素
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鱼腥草芩蓝合剂（Yuxingcao Qinlan Mixture）为中药制剂，由鱼腥草、黄芩、板蓝根、连翘、金银花5味中药组成。黄芩素（Baicalein）为黄芩中的主要活性成分。目前，对鱼腥草芩蓝合剂中黄芩素的含量测定鲜有文献报道，本研究建立了鱼腥草芩蓝合剂中黄芩素的HPLC检测方法并对其含量进行测定，以期对该合剂质量控制提供参考。

1、材料

1.1 仪器

安捷伦1200高效液相色谱仪（配有四元泵、自动进样器、柱温箱和VWD检测器），KQ-310E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），电子天平[奥豪斯仪器（上海）有限公司，感量：0.01mg]。

1.2 试药

鱼腥草芩蓝合剂批号分别为220312、220314、220315、220317、220319、220321、220322（浙江惠松制药有限公司）；黄芩素对照品批号为PS011529，纯度为99.51%（成都普思生物科技股份有限公司）；乙腈、甲醇均为色谱纯（美国天地公司）；磷酸为分析纯（杭州高晶精细化工有限公司）；水为超纯水。

2、方法

2.1 色谱条件

鱼腥草芩蓝合剂中黄芩素有效分离的色谱条件为：色谱柱SHIMSEN Ankylo C18 (4.6 mm×250 mm,5μm）；柱温40℃；紫外检测波长275nm；进样量10μL；流动相为乙腈-0.1%磷酸，等度洗脱（32∶68）；洗脱时间60 min（黄芩素对照品溶液洗脱时间为30 min）；流速1.0 mL/min。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取黄芩素对照品10.83 mg（纯度99.51%），置于100 mL容量瓶中，甲醇超声溶解并定容，即得0.1078 mg/mL的对照品储备液；精密吸取该对照品储备液15 mL，置于25 mL容量瓶中，甲醇稀释并定容，即得0.0647 mg/mL的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取各批次鱼腥草芩蓝合剂，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.4 阴性样品溶液的制备

依照鱼腥草芩蓝合剂的处方和工艺，制备缺黄芩的阴性样品溶液，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

3、结果

3.1 专属性试验

取“2.2”项下的对照品溶液、“2.3”项下的供试品溶液、“2.4”项下的阴性样品溶液，按照“2.1”项下的色谱条件下进样测定，结果见图1。各成分分离度良好，合剂中其他共存物质对测定结果无干扰，理论塔板数以黄芩素计，不得低于3000。

3.2 标准曲线的制备

吸取对照品溶液1、2、4、10、15、20μL进样，测定黄芩素峰面积，以对照品浓度X对峰面积Y进行线性回归，得黄芩素回归方程Y=46825X-35.816,r=1.0000，结果见表1。

表1 黄芩素对照品浓度和峰面积

3.3 精密度试验

取“2.2”项下的对照品溶液，按照“2.1”项下的色谱条件连续进样6次，所得黄芩素峰面积RSD为0.47%，可知仪器精密度良好。

3.4 稳定性试验

取220312批次的复方鱼腥草芩蓝合剂，按照“2.3”项下的方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下的色谱条件进样。进样时间分别为0、2、4、8、12、24 h，所得黄芩素峰面积RSD为1.97%，可知供试品溶液在24 h内稳定性良好。

3.5 重复性试验

取220312批次的复方鱼腥草芩蓝合剂，按照“2.3”项下的方法制备供试品溶液，平行制备6份，按照“2.1”项下的色谱条件进样，所得黄芩素峰面积RSD为1.81%，可知该方法重复性良好。

3.6 回收率试验

精密移取已知含量（批号：220312）的鱼腥草芩蓝合剂供试品溶液12.5 mL至25 mL容量瓶中，精密加入“2.2”项下的对照品溶液6.25 m L，甲醇稀释并定容，按照“2.3”项下的方法制备供试品溶液，平行制备6份，按照“2.1”项下的色谱条件进样，测定峰面积，计算含量，结果见表2。测得黄芩素平均回收率为99.29%,RSD为1.16%。

图1 黄芩素对照品、鱼腥草芩蓝合剂和阴性样品HPLC色谱图

表2 回收率试验结果

3.7 含量测定

取7批鱼腥草芩蓝合剂供试品，按照“2.3”项下的方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下的色谱条件进样，测定峰面积，计算含量，结果见表3。

表3 鱼腥草芩蓝合剂含量测定结果

4、讨论与结论

4.1 阴性样品的制备

为了考察鱼腥草芩蓝合剂中其他成分对黄芩素测定的干扰情况，制备了缺黄芩的阴性样品溶液，结果表明鱼腥草芩蓝合剂中的其他成分对黄芩素的色谱峰均无干扰，该含量测定方法专属性强。

4.2 检测波长的选择

根据文献[1,2]报道的黄芩素在275 nm处有最大吸收，故选择275 nm为检测波长。

4.3 流动相的选择

本实验考察了甲醇-0.1%磷酸，乙腈-0.1%磷酸，乙腈-0.2%磷酸三个溶剂系统，结果显示以乙腈-0.1%磷酸为流动相所得色谱峰峰形最好，分离效果最佳。

4.4 洗脱时间的选择

本实验的HPLC洗脱结果表明，在保证黄芩素色谱峰有效分离的色谱条件下，鱼腥草芩蓝合剂供试品溶液的色谱图中色谱峰在60 min后不再出现；而黄芩素对照品溶液在17.5 min左右出现黄芩素色谱峰后也没有其他色谱峰出现。在保证色谱峰没有互相干扰的前提下，出于节约实验时间考虑，将鱼腥草芩蓝合剂供试品溶液的HPLC洗脱时间设置为60 min，黄芩素对照品溶液的HPLC洗脱时间设置为30 min。

4.5 柱温的选择

本实验考察了25、30、35、40℃四种柱温，结果表明在以上四种柱温的实验条件下黄芩素都能得到较好分离，但实验时间有差别，只有在柱温40℃的条件下实验时间能控制在60 min之内，所以本实验的柱温设置为40℃。

5、结论

本实验建立了HPLC法测定鱼腥草芩蓝合剂中黄芩素的含量，本方法操作简单，精密度、稳定性、重复性好，可用于该合剂的质量控制。

参考文献:

[1]侯学智,张振秋,尤春雪,等.HPLC测定黄芩中6个成分的含量[J].中国现代应用药学,2012,29(11):1010-1014.

[2]赵亮,王新霞,吕磊,等.HPLC法测定清肝散结颗粒中黄芩苷､汉黄芩苷､野黄芩苷､黄芩素及汉黄芩素[J].中成药,2014,36(2):313-318.

文章来源:崔晓甜,汪叶昕,温浩,等.高效液相色谱法测定鱼腥草芩蓝合剂中黄芩素[J].天津化工,2024,38(03):54-55+59.