海洋环境具有特殊性，比如高盐、高压、低氧、低温、弱光、寡营养等，导致海洋中的生物可以产生较为独特的代谢产物[1]。海洋天然产物的数量众多，目前发现的海洋天然产物的数量已经超过35 000个，据统计，仅2022年1年，发表的海洋天然产物（marine natural products,MNPs）中新化合物就有1 417个[2]，其来源涉及海洋中的微生物、浮游植物、海绵、蓝藻等。目前，已有多种海洋药物在国内外获得批准上市，如抗病毒药物阿糖腺苷（Vidarabine)[3]、抗代谢药物阿糖胞苷（Cytarabine)[4]、抗菌药物头孢菌素C(Cephalosporin C)[5]、抗结核药物利福霉素（Rifamycin)[6]、镇痛药物齐考诺肽（Ziconotide)[7,8]、抗癌药物艾日布林（Halaven)[9,10]、抗癌药物曲贝替定（Yondelis)[11,12,13]、靶向治疗药物布雷替尼（Adcetris)[14,15]、多发性骨髓瘤治疗药物奥比西酯（Plitidepsin)[16,17]等，这些药物对于人类健康事业具有十分重要的价值。根据2010—2013年的1项海洋微生物天然产物调查[18]，海洋真菌来源的天然产物中有22%是从青霉属真菌中发现的，青霉属真菌在海洋真菌活性天然产物发现中占有重要地位。青霉属真菌产生的活性次级代谢产物种类众多，主要有生物碱类[19,20]、萜类[21,22]、聚酮类[23,24]、肽类[25,26]等类型，所具有的活性也十分丰富[27]。

青霉Penicillium sp.LHW5975是一株从采自西沙群岛海域海绵Dysidea sp.样本中分离获得的共附生真菌，本研究对Penicillium sp.LHW5975的次级代谢产物进行了化学成分和生物活性研究。Penicillium sp.LHW5975的大米发酵产物经过甲醇提取、醋酸乙酯萃取后得到醋酸乙酯层，通过减压硅胶柱色谱对其进行分离，所获得流分经过ODS中压柱色谱以及高效液相色谱（HPLC）等多种色谱学方法进行进一步分离纯化，获得9个化合物（图1），包括1个新的化合物，命名为青霉吲哚碱甲（1），以及8个已知化合物，分别为17-羟基短密青霉酰胺N(17-hydroxybrevianamide N,2）、苯并玛尔维碱A (benzomalvin A,3）、苯并玛尔维碱B(benzomalvin B,4）、苯并玛尔维碱C(benzomalvin C,5）、苯并玛尔维碱D(benzomalvin D,6）、苯并玛尔维碱E(benzomalvin E,7）、(-)-苯并玛尔维碱E[(-)-benzomalvin E,8]和N-甲基诺喔苯并玛尔维碱A(N-methylnovobenzomalvin A,9）。此外，评价了分离所得化合物对斑马鱼的促血管生成活性，化合物2和7具有一定的促血管生成活性。

图1 化合物1～9的结构   

1、仪器与材料

1.1 仪器与试剂

Waters 1525/2996半制备高效液相色谱（Waters公司，美国），半制备色谱柱YMC-Pack Pro C18 RS(250 mm×10 mm,5μm,YMC公司，日本），Waters Xevo G2-XS Q-Tof、Waters Q-Tof micro YA019液质联用仪（Waters公司，美国），Bruker AVANCE-600MHz核磁共振仪（Bruker公司，德国），Interchim puriflash 450 instruments中压色谱仪（Interchim公司，法国），JASCO FT/IR-4100分光光度计（JASCO公司，日本），柱色谱硅胶（200～300、300～400目，山东青岛海洋化工有限公司），分析级甲醇和乙腈、二氯甲烷（上海凌峰化学试剂有限公司），色谱级甲醇和乙腈（Merck公司，德国），丹红注射液（批号22111047，山东丹红制药有限公司）。

1.2 菌株来源

青霉Penicillium sp.LHW5975从采自西沙群岛海域的海绵Dysidea sp.样本中分离获得，通过观察形态学特征并结合分子生物学技术（18S r RNA）鉴定其为Penicillium sp.。目前该菌株冻存于上海交通大学附属仁济医院海洋药物研究中心。

2、方法

2.1 发酵培养

2.1.1 菌株培养基

PDA培养基：葡萄糖马铃薯肉汤（PDB)17.5 g、海盐0.5 g、去离子水500 m L。

大米发酵培养基：蛋白胨0.6 g、麦芽提取物0.6g、味精0.2 g、海盐3.4 g、大米107 g、去离子水225 m L。

2.1.2 菌株发酵

从-80℃冰箱中取出Penicillium sp.LHW5975甘油冻存管，用小烧杯取适量碎冰，将冻存管插到冰中缓慢解冻。将真菌接种至PDA平板上，使其复苏活化。做好标记后放入28℃培养箱，培养3～5 d。在活化好的平板上挑选形态良好的Penicillium sp.LHW5975单菌落，接种至PDA平板上，于28℃培养箱中培养3～5 d。将纯化好的Penicillium sp.LHW5975琼脂板切成小块，接种于大米培养基（2 L锥形瓶，50瓶）上，室温25℃静置培养35 d。

2.2 提取与分离

将大米发酵物用甲醇超声提取，得到粗浸膏97g。将粗浸膏用醋酸乙酯-水（1∶1）进行萃取，得到醋酸乙酯提取物40 g。过真空液相色谱（VLC），石油醚-醋酸乙酯（100∶0、100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、0∶100）和醋酸乙酯-甲醇（50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、1∶1、0∶100）梯度洗脱，得到83个初始流分，通过TLC与HPLC分析，将其合并成6个流分G1～G6,G3(638.1 mg）经ODS中压柱色谱，乙腈-水（10%→100%,490min）梯度洗脱获得11个流分（Fr.1～11）。流分Fr.3(124.5 mg）经过半制备HPLC（乙腈-0.1%甲酸水50∶50）纯化，得到化合物1(3.8 mg,t R=16 min）、6(4.1 mg,t R=8 min）和9(7.2 mg,t R=21 min）；流分Fr.4(70.4 mg）经过半制备HPLC（乙腈-0.1%甲酸水40∶60）纯化，得到化合物2(5.6 mg,t R=17 min）、3(6.6 mg,t R=25 min）；流分Fr.6(88.5mg）经过半制备HPLC（乙腈-0.1%甲酸水60∶40）纯化，得到化合物4(4.8 mg,t R=13.5 min）、5(5.2mg,t R=15.5 min）；流分Fr.7(158.4 mg）为化合物7；流分Fr.9(18.2 mg）经过半制备HPLC（乙腈-0.1%甲酸水50∶50）纯化，得到化合物8(2.9mg,t R=13 min）。

3、结构鉴定

化合物1：黄色粉末，易溶于甲醇和二氯甲烷。HRESI (-)准分子离子峰m/z 218.080 6[M-H]-（计算值218.081 7,C12H12NO3）给出分子式为C12H13NO3，提示含7个不饱和度。UV (Me OH)光谱在224、319nm处有吸收峰，IR (KBr)光谱在1 600、1 440、1 302、1 243、1 191 cm-1等波数处有强吸收峰，提示结构中含有共轭羰基和苯环等结构片段。

1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)（表1）显示出13个质子信号：1个活泼氢信号(δH 9.51,1H,s);3个芳香质子信号H-2 (δH 6.48,1H,s)、H-6 (δH 6.62,1H,d,J=3.0 HZ)和H-8 (δH 6.56,1H,d,J=3.0 HZ);2个甲氧基氢信号H3-12 (δH 3.58,3H,s)和H3-13(δH 3.51,3H,s)以及1个与双键相连的单峰甲基氢信号H3-11 (δH 2.23,3H,s)。根据偶合常数推测H-6和H-8是1个苯环上处于间位的2个芳香氢信号。13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6)和DEPT135谱显示该化合物含有12个碳：1个羰基碳信号C-10 (δC165.5);8个烯烃碳信号C-2 (δC 112.2)、C-3 (δC113.8)、C-4 (δC 137.9)、C-5 (δC 111.5)、C-6 (δC 107.4)、C-7 (δC 151.9)、C-8 (δC 104.9)和C-9 (δC 152.8);2个甲氧基碳信号C-12 (δC 51.6)和C-13 (δC 56.3)以及1个甲基碳信号C-11 (δC 20.2)。

表1 化合物1的NMR数据(600/150 MHz,DMSO-d6)  

在HMBC谱（图2）中，H-6显示与C-4和C-8有远程相关，H-8和C-4、C-6、C-7以及C-9之间有远程相关，可以确定1个苯环结构片段的存在（图2）。H-6/C-10和H-13/C-7之间的HMBC相关提示了该苯环是1个1,3,4,5-四取代苯环。H3-11/C-2、C-3、C-4和H-2/C-3、C-5之间的HMBC相关，结合C-9化学位移值向低场偏移(δC 152.8)，提示结构中含有吲哚骨架，同时确定了CH3-11位于吲哚环的C-3位。H-6/C-10之间的HMBC相关确定了羰基C-10位于吲哚环C-5位。甲氧基氢信号H3-12和H3-13分别与C-10和C-7存在HMBC相关，确定了这2个甲氧基分别连接在C-10和C-7位。根据以上一维和二维核磁谱数据，确定了化合物1的结构。经过Sci Finder检索发现，该化合物是未有文献报道的新化合物，命名为青霉吲哚碱甲（penicindoline A）。

图2 化合物1的HMBC相关   

化合物2：白色固体，1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δ:7.96 (1H,d,J=7.8 Hz,H-6),7.86 (1H,t,J=7.8 Hz,H-7),7.65 (1H,t,J=7.8 Hz,H-8),8.39 (1H,d,J=8.4Hz,H-9),5.96 (1H,dd,J=4.8,3.6 Hz,H-13),3.31 (1H,dd,J=14.4,3.0 Hz,H-15a),3.79 (1H,dd,J=14.4,4.8Hz,H-15b),6.75 (2H,d,J=5.4 Hz,H-17,18),7.10(1H,m,H-19),6.59 (1H,d,J=8.4 Hz,H-20),3.18 (3H,s,H3-22);13C-NMR (150 MHz,CDCl3) δ:156.9 (C,C-2),134.7 (C,C-3),146.6 (C,C-5),129.5 (CH,C-6,C-8),135.2 (CH,C-7),127.1 (CH,C-9),121.8 (C,C-10),160.1 (C,C-11),56.9 (CH,C-13),167.8 (C,C-14),33.1 (CH2,C-15),119.4 (C,C-16),131.7 (CH,C-17),121.4 (CH,C-18),130.2 (CH,C-19),116.0 (CH,C-20),154.6 (C,H-21),27.5 (CH3,C-22)。以上NMR数据与文献中报道一致[28]，确定化合物2为17-hydroxybrevianamide N。

化合物3：无色无定型固体，1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6) δ:7.83 (2H,m,H-4,15),7.63 (2H,m,H-5,13),7.69 (1H,m,H-6),7.71 (1H,m,H-7),8.35 (1H,t,J=8.4 Hz,H-12),7.93 (1H,d,J=7.8 Hz,H-14),4.90(1H,t,J=7.2 Hz,H-19),3.82 (1H,dd,J=14.4,7.8Hz,H-20a),3.44 (1H,dd,J=14.4,7.2 Hz,H-20b),7.56(3H,m,H-22,24,26),7.28 (2H,m,H-23,25),3.11(3H,s,H3-27);13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6) δ:167.5 (C,C-2),133.1 (C,C-3,8),130.0 (CH,C-4),129.1 (CH,C-5,22,26),131.1 (CH,C-6),128.8 (CH,C-7,23,25),161.4 (C,C-10),121.8 (C,C-11),127.8(CH,C-12,15),127.6 (CH,C-13),135.0 (CH,C-14),146.1 (C,C-16),152.0 (C,C-18),58.4 (CH,C-19),33.3(CH2,C-20),136.8 (C,C-21),127.0 (CH,C-24),28.4(CH3,C-27)。以上NMR数据与文献中报道一致[29]，确定化合物3为benzomalvin A。

化合物4：黄色固体，1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6) δ:7.86 (2H,m,H-4,14),7.63 (3H,m,H-5～7),8.25 (1H,dd,J=7.9,1.6 Hz,H-12),7.54 (1H,d,J=7.6 Hz,H-13),7.78 (1H,dd,J=7.2,1.7 Hz,H-15),7.05 (1H,s,H-20),7.26 (5H,m,H-22～26),3.33(3H,s,H3-27);13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6) δ:164.8 (C,C-2),133.0 (C,C-3),130.8 (CH,C-4),131.6(CH,C-5),128.8 (CH,C-6),126.9 (CH,C-7),132.2 (C,C-8),160.7 (C,C-10),121.8 (C,C-11,C-21),127.6(CH,C-12),128.2 (CH,C-13),135.0 (CH,C-14),127.9(CH,C-15),146.6 (C,C-16),151.5 (C,C-18),129.1 (C,C-19),132.4 (CH,C-20),128.6 (CH,C-22,C-26),128.9 (CH,C-23,25),129.3 (CH,C-24),35.6 (CH3,C-27)。以上NMR数据与文献中报道一致[30]，确定化合物4为benzomalvin B。

化合物5：白色固体，1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6) δ:7.95 (1H,dd,J=7.8,1.5 Hz,H-4),7.56(1H,brdd,J=7.8,7.8 Hz,H-5),7.43 (1H,m,H-6),6.87(1H,m,H-7),8.09 (1H,dd,J=7.6,2.0 Hz,H-12),7.54(1H,dd,J=7.6,7.0 Hz,H-13),7.86 (1H,m,H-14),7.89 (1H,m,H-15),3.42 (1H,s,H-20),6.59 (1H,d,J=7.5 Hz,H-22),7.09 (2H,m,H-23,25),7.17 (1H,m,H-24),6.60 (1H,d,J=7.5 Hz,H-26),3.17 (3H,s,H-27);13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6) δ:164.9 (C,C-2),131.4 (C,C-3),129.5 (CH,C-4),129.0 (CH,C-5),130.9 (CH,C-6),126.8 (CH,C-7),131.5 (C,C-8),160.0 (C,C-10),121.6 (C,C-11),127.8 (CH,C-12),128.3 (CH,C-13),135.3 (CH,C-14),128.2 (CH,C-15),145.5 (C,C-16),147.7 (C,C-18),72.1 (C,C-19),66.7(CH,C-20),130.6 (C,C-21),125.6 (CH,C-22,26),128.1 (CH,C-23,25),129.1 (CH,C-24),28.7 (CH3,C-27)。以上NMR数据与文献中报道一致[30]，确定化合物5为benzomalvin C。

化合物6：无色固体，1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6) δ:7.28 (4H,m,H-4,14,22,26),7.84 (1H,m,H-5),7.63 (1H,m,H-6),7.83 (1H,m,H-7),7.69(1H,m,H-8),8.06 (1H,d,J=7.8 Hz,H-13),7.63 (1H,m,H-15),4.80 (1H,dd,J=10.8,6.0 Hz,H-19),2.80(1H,dd,J=13.8,5.4 Hz,H-20a),2.39 (1H,dd,J=13.8,10.8 Hz,H-20b),7.96 (2H,d,J=7.8 Hz,H-23,25),7.56 (1H,m,H-24),2.97 (3H,s,H3-27);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6) δ:165.6 (C,C-2),133.2 (C,C-3),130.8 (CH,C-4),131.3 (CH,C-5),129.1 (CH,C-6),128.3 (CH,C-7),136.0 (C,C-8),161.7 (C,C-10),121.6(C,C-11),127.9 (CH,C-12),127.5 (CH,C-13),129.0(CH,C-14,C-22,26),135.2 (CH,C-15),146.5 (C,C-16),153.9 (C,C-18),70.5 (CH,C-19),36.0 (CH2,C-20),132.3 (C,C-21),127.8 (CH,C-23,25),129.2 (CH,C-24),38.4 (CH3,C-27)。以上NMR数据与文献中报道一致[29]，确定化合物6为benzomalvin D。

化合物7：白色固体，1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6) δ:7.97 (1H,td,J=8.4,1.2 Hz,H-4),7.70(1H,dd,J=8.4,1.2 Hz,H-5),7.80 (1H,td,J=8.4,1.2Hz,H-6),7.64 (1H,td,J=7.8,1.8 Hz,H-7),8.32 (1H,dd,J=7.8,1.2 Hz,H-12),7.75 (1H,dd,J=8.4,1.2 Hz,H-13),7.33 (3H,m,H-14,15,24),4.63 (1H,d,J=10.2Hz,H-19),4.07 (1H,d,J=10.8 Hz,H-20),7.15 (2H,dd,J=7.8,1.8 Hz,H-22,26),7.54 (2H,td,J=7.8 Hz,2.4 Hz,H-23,25),2.71 (3H,s,CH3-27);13C-NMR (150MHz,DMSO-d6) δ:165.6 (C,C-2),132.1 (C,C-3),130.7(CH,C-4),129.2 (CH,C-5),131.4 (CH,C-6),128.7 (CH,C-7),132.9 (C,C-8),161.7 (C,C-10),121.5 (C,C-11),127.6 (CH,C-12),127.9 (CH,C-13),135.1 (CH,C-14),127.8 (CH,C-15),146.6 (C,C-16),153.0 (C,C-18),74.9(CH,C-19),71.6 (CH,C-20),140.4 (C,C-21),126.3 (CH,C-22,26),129.1 (CH,C-23,25),129.3 (CH,C-24),38.1(CH3,C-27)。以上NMR数据与文献中报道一致[31]，确定化合物7为benzomalvin E。

化合物8：白色固体，1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6) δ:7.97 (1H,td,J=8.4,1.2 Hz,H-4),7.70(1H,dd,J=8.4,1.2 Hz,H-5),7.80 (1H,td,J=8.4,1.2Hz,H-6),7.64 (1H,td,J=7.8,1.8 Hz,H-7),8.32 (1H,dd,J=7.8,1.2 Hz,H-12),7.75 (1H,dd,J=8.4,1.2 Hz,H-13),7.33 (3H,m,H-14,15,24),4.63 (1H,d,J=10.2Hz,H-19),4.07 (1H,d,J=10.8 Hz,H-20),7.15 (2H,dd,J=7.8,1.8 Hz,H-22,26),7.54 (2H,td,J=7.8,2.4Hz,H-23,25),2.91 (3H,s,H3-27);13C-NMR (150MHz,DMSO-d6) δ:166.6 (C,C-2),131.1 (C,C-3),132.7 (CH,C-4),127.2 (CH,C-5),130.4 (CH,C-6),128.7 (CH,C-7),132.9 (C,C-8),161.7 (C,C-10),121.5(C,C-11),127.6 (CH,C-12),127.9 (CH,C-13),135.1(CH,C-14),127.8 (CH,C-15),146.6 (C,C-16),153.0(C,C-18),60.9 (CH,C-19),71.6 (CH,C-20),140.4 (C,C-21),126.3 (CH,C-22,26),129.1 (CH,C-23,25),129.3 (CH,C-24),31.1 (CH3,C-27)。以上NMR数据与文献中报道一致[32]，确定化合物8为(-)-benzomalvin E。

化合物9：黄色固体，1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6) δ:7.84 (1H,m,H-4),7.63 (1H,m,H-5),7.68 (2H,m,H-6,7),8.33 (1H,dd,J=7.8,1.8 Hz,H-12),7.54 (1H,m,H-13),7.86 (1H,m,H-14),7.78 (1H,dd,J=7.8,1.6 Hz,H-15),4.94 (1H,dd,J=8.4,6.6 Hz,H-19),3.48 (1H,dd,J=15.0,8.4 Hz,H-20a),3.58 (1H,dd,J=15.0,6.6 Hz,H-20b),7.30 (2H,m,H-22,26),7.62 (2H,m,H-23,25),7.25 (1H,m,H-24),2.90 (3H,s,H3-27);13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6) δ:166.7(C,C-2),131.3 (C,C-3),129.1 (CH,C-4),128.9 (CH,C-5,22,26),132.8 (CH,C-6),128.6 (CH,C-7),132.9(C,C-8),160.8 (C,C-10),121.3 (C,C-11),128.2 (CH,C-12),127.7 (CH,C-13),135.2 (CH,C-14),127.7 (CH,C-15),145.6 (C,C-16),152.7 (C,C-18),58.0 (CH,C-19),32.3 (CH2,C-20),137.2 (C,C-21),128.5 (CH,C-23,25),127.5 (CH,C-24),27.6 (CH3,C-27)。以上NMR数据与文献中报道一致[33]，确定化合物9为N-methylnovobenzomalvin A。

4、促血管生成活性筛选及结果

雌雄斑马鱼分开喂养，照明14 h与黑暗10 h交替进行，定时饲喂人工颗粒状饵料以及刚孵出的卤虫无节幼体。取健康性成熟的斑马鱼按照雌雄比例1∶1放入交配缸内，次日9:00～10:00获得受精卵。对受精卵进行消毒洗涤之后移入斑马鱼胚胎培养用水（含0.17 mmol/L KCl、5.0 mmol/L Na Cl、0.16mmol/L Mg SO4、0.4 mmol/L Ca Cl2）中，于28℃下控光培养。取受精24 h的斑马鱼胚胎Tg(vegfr2:GFP），使用1 mg/m L链酶蛋白酶E溶液脱去卵膜，随机分组，即对照组、模型组（造模试剂PTK787）、阳性对照组（丹红注射液）及样品组，每组10条，2个平行重复。模型组、阳性对照组、样品组给予PTK787(0.2µg/m L），阳性对照组给予丹红注射液（10µL/m L），样品组给予化合物样品（50µg/m L），在光照培养箱中28℃培养。给药24 h后于荧光显微镜下观察斑马鱼节间血管生长情况并拍照，计数血管条数。结果显示（图3），用化合物2和7处理的斑马鱼节间血管生长数目在质量浓度为50µg/m L时显著增多，说明在50µg/m L质量浓度下化合物2和7对斑马鱼的血管生长有促进作用。

图3 斑马鱼促血管生成活性结果  

5、讨论

本研究从海绵Dysidea sp.的共附生青霉Penicillium sp.LHW5975的发酵产物中分离得到9个生物碱类化合物，其中化合物1为新化合物，命名为青霉吲哚碱甲（penicindoline A）。化合物2和7对斑马鱼显示出促血管生成活性，在50µg/mL质量浓度时使斑马鱼血管数目增多。该研究提示海洋来源的青霉是活性天然产物发现的重要来源，极具开发价值和发展前景。

参考文献:

[1]张诗,张颖,宁耀东,等.海洋微生物次级代谢产物抗炎作用研究进展[J].中国海洋药物, 2023, 42(5):81-90.

[31]徐启航,安法梁,李蕾,等. 1株蓝藻来源真菌Aspergillus sp.的次生代谢产物研究[J].中国海洋药物, 2019, 38(1):28-32.

基金资助:国家重点研发计划项目(2022YFC2804100);国家自然科学基金项目(82022068);国家自然科学基金项目(22137006);

文章来源:谢冬冬,李嘉欣,李培海,等.一株海绵共附生青霉Penicillium sp.的次级代谢产物研究[J].中草药,2024,55(10):3223-3229.