首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 药学论文 > 中药学论文 > HPLC法测定益气化瘀口服液中阿魏酸含量

HPLC法测定益气化瘀口服液中阿魏酸含量

2024-06-12 34 上传者：管理员

摘要：目的建立测定益气化瘀口服液中阿魏酸含量的高效液相色谱(HPLC)法。方法色谱柱：TIANHE C18(4.6×250 mm, 5μm),流动相采用乙腈-1%醋酸水溶液系统，比例为17∶83,流速：1 ml/min,检测波长：316 nm,柱温：35℃,进样量10μl。结果阿魏酸进样浓度在0.027 2～0.272 mg/ml范围内与峰面积线性关系良好，平均回收率为99.71%,RSD为3.49%(n=6);阿魏酸含量0.11 mg/ml。结论建立的HPLC方法精密度高、分离度好、重现性好，阴性无干扰，保留时间适宜，可用于益气化瘀口服液中阿魏酸的含量测定。

关键词：
保护心血管
含量测定
益气化瘀口服液
阿魏酸
高效液相色谱法
加入收藏

益气化瘀口服液原方出自荆州市中医医院名老中医刘云鹏主任医师养生保健经验方，现被其医院制剂中心研发成院内特色中药制剂并获得湖北省制剂批文(鄂药制字Z20210311),已用于临床50余载。益气化瘀口服液由当归、黄芪、牛膝、丹参、红花、桃仁等16味药材组成，经煎煮、浓缩、醇沉、离心、灭菌等工艺制作而成，具有益气化瘀活血之功效，还具有止痛、通便、保护心血管作用，在治疗气虚血瘀所致中风后遗症、冠心病、高脂血症等方面有良好效果[1,2,3,4,5]。

2015年版《中国药典(一部)》将阿魏酸作为当归的质量控制指标[6]。本研究采用高效液相色谱(HPLC)法测定益气化瘀口服液中阿魏酸含量，以完善其质量标准。现报道如下。

1、仪器、试剂与试药

1.1仪器

Waters Alliance高效液相色谱仪，配备515型泵、717型自动进样器及二极管阵列检测器(Waters公司),超声波清洗器(KH5200V型，购自上海沪粤明科学仪器有限公司),电子天平(HZT-A+100型，购自上海众渊实业有限公司),超纯水器(D24UV型，购自上海密理博贸易有限公司)。

1.2试剂

甲醇(色谱级)购自东阳华鼎化工甲醇厂；磷酸溶液(分析纯)、冰醋酸(分析纯)购自江苏弘辉化工有限公司；试验用水为超纯水，乙腈、正丁醇、氨水均为分析纯。

1.3试药

阿魏酸对照品(批号0721-201901),购自中国食品药品检定研究院。益气化瘀口服液(荆州市中医医院制剂中心，批号分别为：20200425、20200814、20201019),用于制备益气化瘀口服液所需药材购于荆州市中药材公司，并经荆州市药品检验所鉴定，结果符合《中国药典》(2020版第一部)各项规定。

2、方法

2.1色谱条件

TIANHE C18(4.6×250 mm, 5μm)色谱柱，流动相采用乙腈-1%醋酸水溶液系统，比例为17∶83,流速：1 ml/min,检测波长：316 nm,柱温：35℃[7,8,9,10,11]。

2.2对照品溶液的制备

采用万分之一天平精密称定阿魏酸对照品125 mg,置于25 ml容量瓶。甲醇溶解并定容，使之浓度为5 mg/ml,用0.45μm微孔滤膜滤过，即得对照品储备液[6]。使用时稀释至适当浓度。

2.3供试品溶液的制备

精确移取本制剂4 ml于10 ml容量瓶中，加70%甲醇至刻度并超声25 min,静置放冷后取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液即可[6]。

2.4阴性样品溶液的制备

按处方量制备不含当归的阴性样品，参照“2.3”供试品制备方法制备成阴性供试品溶液。

2.5测定方法

用“2.2”中对照品溶液稀释适当的浓度梯度，配置成6个不同浓度的系列对照品溶液，使用微孔滤膜滤过，注入HPLC进行分析。绘制标准曲线，以峰面积为纵坐标，并以样品浓度为横坐标(mg/ml)来研究线性范围。

2.5.1对照品的制备：

取阿魏酸的对照品溶液，不断稀释并进样分析，直至信噪比达到10为止，记录此时的阿魏酸浓度。

2.5.2精密度测定：

取一定浓度的标准品对照溶液注入高效液相色谱仪。连续进样6次，记录阿魏酸的峰面积，计算峰面积的RSD,考察精密度。

2.5.3方法重复性验证：

取同一批次的益气化瘀口服液样品6份，按照“2.3”中的方法制备待测溶液。注入高效液相色谱仪，重复进样2次，计算阿魏酸含量的RSD,考察所建方法之重复性。

2.5.4稳定性测定：

以相同研究对象作为供试品，分别在0、1、2、4、8、16和24 h注入样品并进行分析。在每个时间点进样2次，计算阿魏酸峰面积的相对偏差，以研究待测溶液的稳定性。

2.5.5回收率测定：

精密量取益气化瘀口服液0.5 ml和对照品溶液0.5 ml,混匀。按“2.3”的方法平行制成6份供试品，考察阿魏酸的加样回收率。

2.5.6样品检测：

取3批样品，每批取样3份，按照益气化瘀口服液供试品方法制备，每份样品进样10μl,记录峰面积，根据峰面积计算阿魏酸含量。

3、阿魏酸含量测定

采用Waters Alliance高效液相色谱仪成功构建阿魏酸的含量测定方法。得到的色谱图见图1。该条件下阿魏酸的色谱峰分离度为1.6,保留时间13 min。

3.1方法学考察结果

精密量取阿魏酸对照品贮备液544、1 088、1 632、2 176、2 720、5 440μl,置100 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为0.027 2、0.054 4、0.081 6、0.108 8、0.136、0.272 mg/ml的系列对照品溶液。精密吸取上述对照品溶液各10μl进样分析，以质量浓度(X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，结果显示阿魏酸进样浓度在0.027 2～0.272 mg/ml范围内呈现良好的线性关系(线性方程为：Y=62.021 1X+0.976 5(r=0.998)。

图1阿魏酸的HPLC色谱图

3.1.1在精密度考察中：

取阿魏酸对照品，按拟定色谱条件，重复进样6次，记录峰面积，结果说明仪器测定阿魏酸时精密度较好(阿魏酸所得峰面积的RSD为0.14%),见表1。

表1精密度试验结果

3.1.2重复性实验结果：

取同一批(20200814)样品制定平行溶液6份，按拟定色谱条件测定，记录峰面积，结果表明该检测方法的重复性良好(阿魏酸峰面积的RSD为1.56%),见表2。

表2重复性实验数据

3.1.3稳定性实验结果：

取益气化瘀口服液(20200814)供试品在1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h分别进样，记录阿魏酸峰面积并计算其RSD值，结果表明24 h内阿魏酸在益气化瘀口服液中有良好的稳定性(阿魏酸峰面积RSD值为2.76%),见表3。

表3稳定性实验结果

3.1.4加样回收率实验结果：

精密量取益气化瘀口服液(批号20200814)0.5 ml(阿魏酸0.11 mg/ml)和对照品溶液0.5 ml(取对照品储备液适量置10 ml容量瓶中加甲醇稀释至0.136 mg/ml),混匀。按“2.3”供试品的制备方法平行制成6份供试品，考察阿魏酸的加样回收率。方法检测出阿魏酸的平均回收率为99.71%,RSD为3.49%,见表4。表明本方法加样回收率符合要求，可用于益气化瘀口服液中阿魏酸的含量测定。

表4加样回收率实验结果

3.2样品检测结果

按照“2.2”中供试品制备方法制备益气化瘀口服液的供试品，进样分析，见表5。三批益气化瘀口服液中阿魏酸含量较为接近，平均含量为0.11 mg/ml,说明不同批次益气化瘀口服液中阿魏酸的含量稳定。

表5益气化瘀口服液中阿魏酸的含量

4、讨论

益气化瘀口服液为医院制剂，目前质量控制标准只有当归、丹参薄层色谱的定性鉴别。从院内自制制剂长远发展角度，结合《中国药典》2020版要求，中药制剂需进行定量分析提升院内制剂的质量标准[12]。本研究在参考相关文献[13,14,15]的基础上，对方中16味中药的理化性质进行理论分析，确定了对方中当归的主要化学成分阿魏酸进行含量测定。

目前，HPLC法测定阿魏酸含量的方法较多，分别采用不同比例的甲醇-1%醋酸、乙腈—水、甲醇—水、甲醇-1%乙酸、甲醇-0.05%moL/L磷酸二氢钾等溶液作为流动相[16,17,18,19,20]。在以上条件下阿魏酸峰与杂质峰不能完全分离，故未采用，改用乙腈-1%醋酸水溶液(17∶83)为流动相时能取得很好分离，分离度>1.5,色谱峰峰形良好，阿魏酸保留时间13 min。因此选用改用乙腈-1%醋酸水溶液(17∶83)为流动相。通过对设备的精密度、检测方法的重复性、供试品的稳定性、回收率等相关指标进行测试，均符合相关要求。对供试品三批次的阿魏酸进行测定，含量较为接近，阿魏酸含量的平均值为0.11 mg/ml。

综上所述，建立的HPLC方法具有精密度高、分离度好、重现性好，阴性无干扰，保留时间适宜等优点，可用于检测阿魏酸，为益气化瘀口服液的质量标准更新提供参考。

利益冲突所有作者声明无利益冲突

参考文献:

[1]徐智,张友志,郭昌洪,等.益气化瘀口服液质量标准研究[J].陕西中医,2019,40(9):1304-1306.

[2]陈伟伟,高润霖,刘力生,等.《中国心血管病报告2017》概要[J].中国循环杂志,2018,33(01):1- 8.

[3]《中国循环杂志》编辑部,中国成人血脂异常防治指南修订联合委员会.《中国成人血脂异常防治指南(2016年修订版)》补充说明[J].中国循环杂志,2017,32(1):53.

[4]赖仁奎,盛小刚,潘光明.高脂血症合并高尿酸血症与冠状动脉病变的相关性[J].广东医学,2016,37(6):895- 897.

[6]国家药典委员会.中华人民共和国药典:2020年版一部[S].北京:中国医药科技出版社,2020:234-235.

[7]王雁梅,申现锋,康美清,等.桃红四物汤中阿魏酸的含量测定[J].中医学报,2015(8):1178-1180.

[8]袁梦哲,李绍峰.当归含量测定时阿魏酸供试品制备条件的实验设计[J].中医学报,2010,25(1):120-121.

[9]倪慧艳.高效液相色谱法测定芪胶升白胶囊中阿魏酸的含量[J].中医学报,2015(1):95- 97.

[10]张一翔,王晓燕,黄霞,等.多波长高效液相法同时测定鼻渊舒口服液中6种成分的含量[J].中医学报,2019,34(5):1034-1038,1047.