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黄芪甲苷通过调节水液代谢改善辐射诱导心肌细胞水肿的研究

2024-07-09 85 上传者：管理员

摘要：目的研究黄芪甲苷(AS-Ⅳ)改善辐射诱导的心肌细胞水肿的有效性及其分子机制。方法将AC16细胞分为空白组、模型组、AS-Ⅳ辐射前给药组(Q组)、辐射后给药组(H组)和前+后给药组(Q+H组)。Q组和Q+H组用40 mol·L-1的AS-Ⅳ含药培养基，其他各组用正常培养基，培养24 h后，除空白组外，其余各组给予6 Gy X射线辐射建立心肌细胞水肿模型，并将Q组更换为正常培养基，H组更换为40 mol·L-1的AS-Ⅳ含药培养基，培养24 h。用钙黄绿素AM染色法观察细胞的水肿情况，用蛋白质印迹法检测水液代谢关键蛋白的表达情况，用Annexin-V/PI流式凋亡检测法检测细胞的凋亡情况。结果空白组、模型组、Q组、H组和Q+H组的细胞水肿面积分别为690.77±199.55、1 184.47±307.36、713.65±152.48、809.72±262.85和897.61±213.66,缺氧诱导因子(HIF)-1α蛋白相对表达水平分别为0.94±0.02、1.35±0.03、0.91±0.03、0.69±0.02和0.86±0.03,水通道蛋白4(AQP4)蛋白相对表达水平分别为0.66±0.03、1.07±0.04、0.67±0.02、0.56±0.03和0.56±0.02,凋亡率分别为(3.90±0.76)%、(16.58±0.63)%、(12.91±0.51)%、(14.05±0.22)%和(12.13±0.38)%。空白组、Q组、H组和Q+H组的上述指标与模型组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 AS-Ⅳ可以通过抑制辐射后AC16细胞HIF-1α/AQP4轴的异常激活，调节水液代谢，改善辐射诱导的心肌细胞水肿，减少细胞凋亡。

关键词：
心肌水肿
水通道蛋白4
缺氧诱导因子-1α
辐射
黄芪甲苷
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放射性心脏损伤(radiation-induced heart disease, RIHD)是放疗时电离辐射损伤周围正常组织所致的心血管不良反应综合征。心肌纤维化被认为是RIHD最关键的病理损伤[1]。心肌水肿是多种病理因素导致心血管系统损伤的早期事件，干预心肌水肿可以截断多种心血管疾病的发生发展[2,3]。心血管水通道蛋白(aquaporins, AQPs)在调节心脏水稳态中具有重要作用[4]。黄芪甲苷(astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ)等黄芪活性成分可以通过调节AQPs异常表达，从而有效改善机体水液代谢异常[5]。本研究明确了辐射诱导心肌细胞水液代谢异常的发生，旨在探索AS-Ⅳ通过调节水液代谢改善辐射诱导心肌细胞水肿的有效性和AS-Ⅳ通过调节AQPs异常表达减轻辐射诱导心肌细胞水肿的相关机制。

一、材料与方法

1 材料

细胞AC16细胞，购自上海中乔新舟生物科技有限公司。

药品与试剂AS-Ⅳ,规格：每瓶20 mg, 纯度：≥98%,批号：HA012079,宝鸡辰光生物科技有限公司生产；钙黄绿素AM,规格：每瓶0.1 mL,批号：01122220415,江苏碧云天生物技术研究所生产。细胞计数法-8(cell counting kit-8,CCK-8)试剂盒，深圳SUNVIEW生物科技公司生产；Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡检测试剂盒，杭州联科生物技术股份有限公司生产；β-肌动蛋白(β-actin)抗体，美国ImmunoWay公司生产；缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)抗体，美国ImmunoWay公司生产；水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)抗体，武汉三鹰生物技术有限公司生产。

仪器IX81活细胞工作站，日本Olympus公司产品；IMARK酶标仪、Chemi Doc凝胶成像分析系统，均为美国Bio-Rad公司产品；XL-100流式细胞仪，美国Becton Dickinson公司产品。

2 实验方法

2.1 细胞培养

AC16细胞用含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基，置于37 ℃、5% CO2的恒温加湿培养箱中培养。

2.2 模型构建

用不同剂量X射线(0、2、4、6、8、16 Gy)干预AC16细胞24 h后，通过钙黄绿素AM染色法筛选出X射线辐射可以诱导AC16细胞水肿的最佳剂量。钙黄绿素AM染色拍照后，用Image J软件分析并计算细胞水肿面积。X射线辐射后AC16细胞面积增加，若在统计学上差异有统计学意义，则被认为是发生了细胞水肿。

2.3 细胞分组与处置方法[6]6]

将细胞分为空白组、模型组、AS-Ⅳ辐射前给药组(Q组)、辐射后给药组(H组)和前+后给药组(Q+H组)。将生长密度达到80%的细胞，以适合浓度接种到6孔板中。Q组和Q+H组用40 mol·L-1的AS-Ⅳ含药培养基培养，其他各组用正常培养基培养；培养24 h后，除空白组外，其余各组给予6 Gy X射线辐射，并将Q组AS-Ⅳ含药培养基更换为正常培养基，H组正常培养基更换为40 mol·L-1的AS-Ⅳ含药培养基，培养24 h后收集细胞检测。

2.4 钙黄绿素AM染色法检测细胞水肿情况[7,8]7-8]

以2 mol·L-1为目的浓度，用无血清DMEM配制钙黄绿素AM染色工作液。按照实验设计处理细胞后，加入钙黄绿素AM染液后，于细胞培养箱避光孵育40 min, 后更换为正常培养基继续培养箱避光孵育30 min, 用磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution, PBS)清洗后，在荧光显微镜下观察并拍照。

2.5 CCK-8法检测细胞活力[9]9]

将对数生长期的AC16细胞按每孔2×103个密度接种到96孔板中，待细胞贴壁后按“2.3”给药方式处理24 h。检测前1 h每孔加入CCK-8液10 μL,置于培养箱孵育1 h, 用酶标仪测定450 nm处的光密度(optical density, OD)值。细胞活力=(OD给药组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)×100%。

2.6 蛋白质印迹法检测水液代谢关键蛋白的表达水平[10]10]

按“2.3”给药方式处理24 h后，用RIPA裂解AC16细胞，离心收集总蛋白。用BCA法定量，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白转至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h, TBST洗膜，室温2 h孵育一抗，TBST洗膜，室温1 h孵育二抗，TBST洗膜后曝光。以β-actin为内参，用Image J软件分析目的条带的灰度值，计算目的蛋白的相对表达水平。

2.7 流式细胞术测定细胞凋亡率[11]11]

按“2.3”给药方式处理24 h后，用不含EDTA胰酶消化收集各组细胞，以1 500 r·min-1离心5 min后，用预冷PBS重悬细胞，继续上述条件离心后，弃PBS,加入1×Binding Buffer 200 μL重悬细胞，并过滤转入流式上样管。每管加入Annexin Ⅴ-FITC溶液5 μL和PI溶液10 μL,室温孵育10 min, 再加入1×Binding Buffer 300 μL后，上机检测。

3 统计学处理

用SPSS 25.0软件进行统计分析。实验数据以

表示，多组间比较用单因素方差分析法。

二、结果

1 不同剂量X射线对AC16细胞水肿的影响

Q组给予40 mol·L-1的AS-Ⅳ含药培养基培养24 h+6 Gy X射线+正常培养基培养24 h; H组给予正常培养基培养24 h+6 Gy X射线+40 mol·L-1的AS-Ⅳ含药培养基培养24 h; Q+H组40 mol·L-1的AS-Ⅳ含药培养基培养24 h+6 Gy X射线+40 mol·L-1的AS-Ⅳ含药培养基培养24 h; 模型组给予正常培养基培养24 h+6 Gy X射线+正常培养基培养24 h; 空白组给予正常培养基培养48 h。

与0 Gy组相比，6 Gy及以上剂量组均可以显著诱导AC16细胞水肿(均P<0.05),见表1。因此，选择以6 Gy X射线干预AC16细胞进行后续实验。

2 AS-Ⅳ不同给药方式干预对6 Gy X射线辐射后AC16细胞的影响

空白组、模型组、Q组、H组和Q+H组的细胞活力分别为1.00±0.06、0.90±0.02、0.94±0.10、0.96±0.02和0.92±0.05。与空白组相比，模型组的细胞活力出现明显抑制(P<0.05)。与模型组相比，Q组、H组和Q+H组均可以不同程度地恢复AC16细胞的细胞活力。

3 AS-Ⅳ改善AC16细胞水肿

空白组、模型组、Q组、H组和Q+H组的细胞水肿面积分别为690.77±199.55、1 184.47±307.36、713.65±152.48、809.72±262.85和897.61±213.66。与空白组相比，模型组出现显著水肿(P<0.05)。与模型组相比，Q组、H组和Q+H组均可以显著改善AC16细胞水肿(均P<0.05)。

4 AS-Ⅳ 抑制HIF-1α/AQP4轴异常激活

空白组、模型组、Q组、H组和Q+H组的HIF-1α蛋白相对表达水平分别为0.94±0.02、1.35±0.03、0.91±0.03、0.69±0.02和0.86±0.03,AQP4蛋白相对表达水平分别为0.66±0.03、1.07±0.04、0.67±0.02、0.56±0.03和0.56±0.02。与空白组相比，模型组的HIF-1α、AQP4蛋白表达水平均明显增加(均P<0.05)。与模型组相比，Q组、H组和Q+H组均可以显著降低HIF-1α、AQP4蛋白表达水平(均P<0.05)。结果见图1。

5 AS-Ⅳ 减少AC16细胞的凋亡形成

空白组、模型组、Q组、H组和Q+H组的细胞凋亡率分别为(3.90±0.76)%、(16.58±0.63)%、(12.91±0.51)%、(14.05±0.22)%和(12.13±0.38)%。与空白组相比，模型组的细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。与模型组相比，Q组、H组和Q+H组均可以显著降低细胞凋亡率(均P<0.05)。

表1 不同剂量X射线辐射24 h对AC16面积的影响

图1 黄芪甲苷(AS-Ⅳ)不同给药方式对AC16细胞中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和水通道蛋白4(AQP4)蛋白表达的影响

三、讨论

临床研究发现，放射治疗中心脏平均剂量增加1 Gy会使心脏暴露毒性风险增加4%[12]。心肌水肿作为急性缺血或炎症损伤后最早发生的组织变化，对于预测心肌病变的可逆性和愈后具有重要的价值[13]。本研究结果发现，6 Gy以上X射线辐射可以诱导显著的AC16细胞水肿，促进细胞凋亡，AS-Ⅳ不同给药方式干预后均可以改善AC16细胞水肿，并减少细胞凋亡。

心肌水稳态依赖于毛细血管滤过、间质水合、心肌细胞吸水和淋巴管清除之间的复杂相互作用[14],水分子需要借助细胞膜上的AQPs以协助扩散的方式进出细胞。AQP4是AQPs家族中转运水能力最强的蛋白，其通过跨膜转运H2O,调节细胞渗透压、血浆渗透压，影响心脏功能，促进了细胞外液在心血管、心室间的重新分配[15]。本研究结果发现，AS-Ⅳ不同给药方式干预均可以通过抑制HIF-1α/AQP4轴的异常激活，改善辐射诱导的AC16细胞水肿。

本研究提示：6 Gy以上X射线辐射可以诱导显著的心肌细胞水肿，AS-Ⅳ能够改善辐射诱导的心肌细胞水肿和细胞凋亡，并且其可能通过抑制HIF-1α/AQP4轴异常激活，从而发挥上述作用。同时，通过干预心肌水肿阻断RIHD和AS-Ⅳ辐射前给药的有效性契合中医“治未病”基本原理，可以为临床防治RIHD和药物开发提供新的思路。

参考文献:

[5]吕琴,赵文晓,孔祥琳,等.黄芪利水功效药理机制研究进展[J].中成药,2021,43(3):729—732.

[6]张尚祖,刘永琦,李洋洋,等.黄芪防治心血管疾病的作用机制研究进展[J].中药药理与临床,2023,39(10):115—124.

基金资助:中国博士后科学基金资助项目(2021M693794); 甘肃省“双一流”科研重点基金资助项目(GSSYLXM-05); 敦煌医学与转化教育部重点实验室开放课题资助项目(DHYX23-09);

文章来源:张尚祖,张利英,李启杨,等.黄芪甲苷通过调节水液代谢改善辐射诱导心肌细胞水肿的研究[J].中国临床药理学杂志,2024,40(13):1874-1877.