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白及多糖对脂多糖诱导的小鼠急性肝损伤的作用及其机制研究

2024-07-10 68 上传者：管理员

摘要：目的研究白及多糖(BSP)对脂多糖(LPS)诱导小鼠急性肝损伤的作用与机制。方法将60只昆明雄性小鼠随机分为空白组(Control组)、模型组(LPS 1mg/kg, Model组)、阳性对照组(2mg/kg联苯双酯滴丸，BDP组)、BSP低、中、高剂量给药组(BSP 100、200、400mg/kg组),Control组和Model组给予生理盐水，其余4组按相应药物剂量，1次/d,连续灌胃7d,最后一次给药2h后，除Control组给予等体积生理盐水，其余5组腹腔注射LPS(1mg/kg)建立急性肝损伤模型，12h后取材，计算肝脏指数，测定血浆中AST、ALT、MDA、SOD、GSH-Px、CAT含量。光镜下观察HE染色后各组小鼠肝脏的组织变化，Western blot法检测各组小鼠肝组织中TLR4/MyD88/NF-κB和TNF-α/IL-1β/IL-6蛋白表达水平。结果与Control组相比，Model组肝脏指数明显上升(P<0.01),血浆中AST、ALT、MDA含量升高(P<0.01),SOD、GSH-Px、CAT含量显著下降(P<0.01),光镜下可见Model组肝小叶结构不清，伴有大量炎症细胞浸润；与Model组相比，BSP干预后降低了肝脏指数，增加了SOD、GSH-Px、CAT含量(P<0.01),显著降低血浆中AST、ALT、MDA含量(P<0.01),TLR4/MyD88/NF-κB和TNF-α/IL-1β/IL-6蛋白表达显著性下调(P<0.05)。结论 BSP对LPS诱导的小鼠急性肝损伤具有保护作用，其机制可能与抗氧化及抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路蛋白和减少TNF-α/IL-1β/IL-6等炎症因子的表达有关。

关键词：
冻疮药
急性肝损伤
白及多糖
脂多糖
连及草
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白及又称白芨、连及草、甘根、冻疮药，是兰科植物白芨[Bletilla Striata(Thunb.)Reichb.f.]的干燥块茎，生长于山谷、山野等较潮湿的地方，分布较广泛，于中国多个省市均有种植[1]。白及多糖(Bletilla striata polysaccharide, BSP)是白及的主要活性成分，因其有着显著的免疫调节、抗氧化、抗癌、止血、抗炎、抗菌、护胃、保肝等功效而备受关注[2,3]。肝脏在体内维持许多重要功能，包括解毒、代谢、蛋白质合成、宿主防御和免疫反应[4]。研究显示脂多糖(LPS)与相应的蛋白结合进入肝脏后与Toll样受体4(TLR4)连接，刺激TLR4介导的MyD 88依赖性通路[5],从而激活NF-κB通路，诱导脂质过氧化、产生促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子-α(TNFα)、白细胞介素6(IL-6)和白细胞介素-1β(IL-1β)[6]。贺国芳等[7]发现白及多糖对小鼠急性酒精性肝损伤有一定保护作用，能够明显降低肝组织中丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性，提高肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)水平，对肝细胞肿胀、变性均有一定改善作用。Luo等[8]研究白及多糖对硫代乙酰胺诱导的肝硬化大鼠上皮屏障破坏的影响，发现白及多糖能够降低内毒素水平，抑制炎性细胞因子IL-6和TNF-α。还有研究显示白及多糖可通过减少肝脏组织中的脂质积累和纤维化来治疗非酒精性脂肪肝[9]。为更好地开发利用白及多糖，在本研究中探讨了白及多糖对LPS诱导的急性肝损伤的保护作用及机制，以期为白及的开发利用提供实验依据。

1、材料与方法

1.1 试剂与仪器

60只健康雄性昆明系小鼠，体重(18±2)g, 购于辽宁长生生物技术股份有限公司，动物许可证号：SCXK(辽)2020-0001。

BSP(陕西泽朗生物科技有限公司，批号ZLSW221117-1,纯度≥98%);联苯双酯滴丸(BDP,万邦德制药集团有限公司，批号19J211148);LPS(Solarbio公司，批号325D031);ALT、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、SOD、过氧化氢酶(CAT)试剂盒(南京建成生物工程研究所);TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6、β-actin、HRP-标记羊抗兔IgG抗体(武汉爱博泰克生物科技有限公司)。

SPARK型酶标仪(瑞士TECAN公司);电泳仪、转印槽、免疫印迹工作站(美国BIO-RAD公司);HI1210摊片机、HI1220烤片机、HistoCore组织脱水机、HistoCore Arcadia C石蜡包埋机、HistoCore AUTOCUT切片机、DM2000正置光学显微镜(Leica公司);低温高速离心机TGL-20M(湖南湘仪离心机仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组及给药

将60只雄性昆明小鼠饲养在标准动物房内[温度22℃～25℃,湿度(50±5)%],适应性喂养7d后，随机分为6组，每组10只，分别为：空白组(Control组)、模型组(LPS 1mg/kg, Model组)、阳性对照组(2mg/kg, BDP组)、低剂量给药组(BSP 100mg/kg组)、中剂量给药组(BSP 200mg/kg组)、高剂量给药组(BSP 400mg/kg组),除Control、Model组外，其他4组按照相应的药物剂量，1次/d, 连续7d灌胃给药，末次给药2h后，采用腹腔注射LPS(1mg/kg)建立急性肝损伤模型，Control组给予等体积生理盐水，禁食，期间自由饮水，在LPS给药12h后眼球取血，处死小鼠取肝组织。

1.2.2 HE染色

将小鼠肝组织浸泡于10%中性甲醛溶液中，固定保存24h, 脱水透明、石蜡包埋切片后，用HE染色，树脂封片，在光学显微镜下进行观察。

1.2.3 血浆生化指标的测定

将收集的血液离心分离血清(4℃,4000r/min, 10min)取上清液，依据试剂盒说明书测定ALT、AST、SOD、MDA、GSH-PX、CAT水平。

1.2.4 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测蛋白表达情况

将肝脏组织剪碎称取30mg, 加入裂解液后离心，提取上清液，采用BCA法测定其浓度，95℃高温变性，再加至10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)胶加样孔内进行恒压电泳；在220mA恒定电流转膜70min, 将蛋白转至PVDF膜，使用脱脂牛奶在摇床上封闭60min后用TBST洗膜，取膜加入TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6、内参β-actin与一抗稀释液(稀释度分别为1∶1000、1∶1000、1∶1000、1∶1000、1∶1000、1∶1000、1∶5000),4℃孵育过夜；次日以TBST洗膜3次后，加入HRP-标记羊抗兔IgG抗体(稀释度为1∶10000),使用摇床在室温下孵育60min; TBST洗膜3次后采用ECL显影定影成像。使用Image Lab软件对图像进行灰度值分析，以目的蛋白/内参蛋白灰度值之间的比值表示相对表达量的变化，从而间接反映蛋白的表达量。

1.3 统计学方法

数据均采用

表示，正态性检验，采用Graphpad prism 8.0软件分析、one-way ANOVA方差分析，并设定P<0.05表明差异有统计学意义。

2、结果

2.1 各组小鼠体重和肝指数水平变化

从体重变化的结果来看，每组小鼠的平均体重都呈现出增长的趋势，表明小鼠在给药期间整体健康状况良好，没有明显的体重下降或生长受阻的情况；同时，观察到各组小鼠的被毛光泽程度正常，表明小鼠在摄食和营养吸收方面均正常；此外，各组小鼠的行为方式和活动情况也没有显著差别，说明药物没有对小鼠的日常行为活动产生负面影响。与Control组相比，Model组肝指数显著性升高(P<0.01),提示肝脏可能存在肿大；与Model组相比，BDP组和BSP 200、400mg/kg组肝指数显著性降低(P<0.01)。见表1。

表1 BSP干预后对小鼠体重及肝指数的影响

2.2 小鼠肝组织外观形态学变化及肝脏组织的病理变化

Control组肝脏外观呈红褐色，表面光滑、质软，形态大小正常；Model组可以看出肝脏伴有点状出血，呈现不同程度的变黄，表面及边缘均有破损；BDP和各BSP给药组肝脏外观表面较为光滑，破损减轻，偶见出血点及异常变化。见图1A。

如图1B所示，Control组的肝小叶结构正常，细胞排列整齐有序，结构清晰，中央静脉附近未见炎性细胞浸润，无细胞坏死、变性等病理变化。Model组肝组织伴有显著的病理变化，包括肝小叶结构不清、肝细胞排列失序、大量炎症细胞浸润、明显的空泡化。相反，与Model组比较，BDP和BSP给药组肝组织病理变化均有明显改善，巨噬细胞的浸润减少，病理改变减轻，BSP 400mg/kg组改善尤为明显，肝小叶结构较为完整，细胞空泡变性明显减少。

图1 小鼠肝组织外观形态学变化及肝脏组织的病理变化

2.3 BSP对LPS致急性肝损伤小鼠血浆中ALT、AST的影响

如表2所示，与Control组比较，Model组ALT和AST含量明显升高(P<0.01),表明LPS诱导小鼠出现明显肝损伤；与Model组相比，BDP组及BSP各剂量给药组可显著降低LPS引起的血浆AST和ALT活性升高(P<0.01)。

表2 各组小鼠ALT、AST的含量

2.4 BSP对LPS致急性肝损伤小鼠血浆中SOD、MDA、GSH-PX、CAT的影响

与Control组比较，Model组中MDA水平显著性升高，SOD、GSH-PX、CAT水平显著降低(P均<0.01);与Model组相比，BDP组与BSP各给药组中MDA水平显著降低，CAT显著性升高(P均<0.01),BDP组与BSP 200mg/kg、400mg/kg组中SOD、GSH-PX水平显著性升高(P均<0.01),且具有统计学意义。见表3。

表3 各组小鼠SOD、MDA、GSH-PX、CAT的含量

2.5 BSP对TLR4/MyD88/NF-κB信号通路蛋白表达的影响

由图2可知，与Control组相比，Model组中TLR4、MyD88、NF-κB的蛋白表达量显著升高(P<0.01);与Model组比较，在BSP 100mg/kg组中TLR4蛋白表达降低(P<0.05),BSP 200mg/kg组NF-κB蛋白表达降低(P<0.05),TLR4、MyD88蛋白表达显著降低(P<0.01),BDP组和BSP 400mg/kg组中3种蛋白表达量均显著降低(P<0.01)。

图2 BSP干预对相关通路蛋白水平的影响(n=3)

2.6 BSP对TNF-α/IL-6/IL-1β炎症相关蛋白表达的影响

由图3可知，与Control组相比，Model组中TNF-α、IL-6、IL-1β的蛋白表达量显著升高(P<0.01);与Model组相比，BSP 200mg/kg组中IL-6蛋白表达降低(P<0.05)、TNF-α蛋白表达显著降低(P<0.01),BDP组和BSP 400mg/kg组中3种蛋白表达量显著降低(P<0.01)。

图3 BSP干预对炎症相关蛋白水平的影响(n=3)

3、讨论

肝脏是机体重要的代谢器官[10,11],炎症是导致肝脏损伤的常见原因之一，由多种致病因素引起，如病毒、药物、酒精、自身免疫性因素等。LPS是免疫系统的有效刺激物，随着LPS浓度越高，增加了机体内炎症介质的表达，诱导体内器官产生炎症损伤[12]。TLR4是LPS的主要信号受体，与肝功能损伤的发病机制和治疗密切相关[13],MyD88是TLR4与LPS相互作用的关键下游信号蛋白，在LPS的作用下，NF-κB通过TLR4-MyD88信号传导途径被激活[14,15],最终导致炎症反应激活和炎症因子的释放。同时，几乎所有肝病都伴随着不同程度的氧化应激，所以有效抑制氧化应激也是保肝护肝的重要手段[16],CAT是肝细胞清除活性氧效能最高的内源性抗氧化酶，是组织氧化应激水平的敏感标志物[17]。MDA为机体内脂质过氧化过程的氧化最终产物，过多会加重肝细胞损伤、坏死，促使炎症因子如TNF-α、IL-6和IL-1β的释放，这些炎症因子又反过来促进氧化应激，使肝损伤进一步加重。同时机体内存在的SOD和GSH-Px可以保护机体免受自由基和活性氧氧化应激的损伤[18]。所以通过调节炎症信号转导途径抑制炎症及抗氧化，可能是防止LPS诱导的急性肝损伤的有效方法。

在本研究中，通过测定小鼠血浆中肝功能相关转氨酶AST、ALT,观察组织病理变化，计算肝脏指数等多方面评价肝脏情况，发现LPS诱导的小鼠血浆AST、ALT水平显著性增高，小鼠肝脏细胞伴有大量炎症细胞浸润、肝索紊乱、肝脏结构不清晰，且小鼠肝指数显著性上升。以上变化都直接表明了腹腔注射LPS建立急性肝损伤模型是成功的，而给药组能够明显改善以上情况。通过检测氧化应激相关指标，Model组比较于Control组MDA水平显著升高，SOD、GSH-Px、CAT活性显著降低；而BSP中、高剂量均能显著降低MDA含量，提高SOD和GSH-Px、CAT活性，提示BSP中、高剂量可以有效降低LPS致急性肝损伤小鼠的氧化应激水平。Western blot结果显示，BSP的干预可以减少LPS诱导的小鼠肝组织中TLR4/MyD88/NF-κB的表达，TNF-α、IL-6和IL-1β的炎症相关蛋白表达也有所下降。所以，BSP对LPS引起的急性肝损伤小鼠有一定的保护作用，其机制可能与抗氧化及抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路有关。本研究结果为BSP进一步开发应用提供一定的理论基础，为BSP作为LPS诱导的肝损伤的有效候选药物提供参考。

参考文献:

[1]葛婷婷,闵清,白育庭.白及的药理作用与临床应用研究进展[J].湖北科技学院学报(医学版),2022,36(6):535

[7]贺国芳,丁伊玲,徐清霞,等.白及多糖对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用[J].中国医院药学杂志,2015,35(18):1658

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[17]高进,殷娟,沈文娟,等.山奈酚对脓毒症大鼠肝损伤的影响及其与HIF-1α/HK2通路的关系[J].中国急救医学,2023,43(4):279

[18]韦敏,李波,王跃峰,等.龙胆苦苷通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路减轻小鼠急性肝损伤的作用[J].中国实验方剂学杂志,2021,27(22):76

文章来源:葛婷婷,陈祺,王洁琼,等.白及多糖对脂多糖诱导的小鼠急性肝损伤的作用及其机制研究[J].湖北科技学院学报(医学版),2024,38(04):277-281.