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苦参碱对神经母细胞瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响

2024-07-19 44 上传者：管理员

摘要：目的观察苦参碱对人神经母细胞瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响，探讨其可能的分子机制。方法实验分为AS实验组(SK-N-AS细胞给予IC50浓度的苦参碱)、AS空白组（SK-N-AS细胞正常培养）、AS对照组（SK-N-AS细胞加入等量二甲基亚砜处理）和DZ实验组(SK-N-DZ细胞给予IC50浓度的苦参碱)、DZ空白组（SK-N-DZ细胞正常培养）、DZ对照组（SK-N-DZ细胞加入等量二甲基亚砜处理）。用划痕实验和Transwell小室检测苦参碱对各组细胞迁移和侵袭能力的影响，用蛋白质印迹法检测苦参碱对各组细胞中E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）蛋白表达的影响。结果各实验组不同干预后，AS空白组、AS对照组、AS实验组、DZ空白组、DZ对照组和DZ实验组的迁移百分率分别为（66.32±3.12）%、（65.27±3.44）%、（23.73±0.79）%、（46.25±4.68）%、（44.15±5.60）%和（16.77±3.52）%,侵袭细胞数分别为（870.45±19.32）、（865.32±23.39）、（492.74±16.81）、（1 198.10±43.71）、（1 203.03±71.91）和（891.69±42.62）个，E-cadherin蛋白表达水平分别为（100.00±11.72）%、（105.65±13.11）%、（477.20±29.71）%、（100.00±12.54）%、（97.78±12.77）%和（240.53±12.23）%,N-cadherin蛋白表达水平分别为（100.00±15.44）%、（103.90±10.76）%、（43.52±9.96）%、（100.00±10.12）%、（104.95±10.49）%和（38.39±8.70）%,Vimentin蛋白表达水平分别为（100.00±9.51）%、（97.39±11.33）%、（59.13±10.25）%、（100.00±13.20）%、（96.27±11.01）%和（47.67±9.48）%。AS实验组的上述指标与AS空白组比较，在统计学上差异有统计学意义（P<0.01、P<0.001）,DZ实验组的上述指标与DZ空白组比较，在统计学上差异有统计学意义（P<0.01、P<0.001）。结论苦参碱抑制人神经母细胞瘤SK-N-AS和SK-N-DZ细胞增殖、迁移和侵袭，其机制可能与抑制上皮间质转化有关。

关键词：
上皮间质转化
侵袭
神经母细胞瘤
苦参碱
迁移
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神经母细胞瘤是儿童最常见肿瘤，发病率约0.3～5.5/10万，仅次于白血病、淋巴瘤和脑瘤，占儿童肿瘤的7%～8%,但死亡率占儿童肿瘤死亡人数的10%～15%[1]。苦参碱是从苦参中分离得到的生物碱，发挥抗炎、抗过敏、免疫调节、镇静镇痛、抗肿瘤等药理作用[2]。研究证实，苦参碱具有广谱抗肿瘤作用[3],其机制包括促进细胞凋亡、诱导自噬、抑制细胞增殖、侵袭、转移、抑制细胞周期、阻滞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)等[4]。本研究旨在观察苦参碱对神经母细胞瘤细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响，探究其潜在分子机制。

一、材料和方法

1 材料

细胞株人神经母细胞瘤SK-N-AS和SK-N-DZ细胞，均购自美国ATCC细胞库。

药品与试剂苦参碱，规格：每瓶100 mg, 纯度：99.73%,批号：S232203,美国Selleck生物科技有限公司生产。细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8),日本Dojindo公司生产；实时荧光定量聚合酶链反应(real time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)试剂盒，日本Takara公司生产；兔抗E-钙黏蛋白(E-cadherin)多克隆抗体、兔抗N-钙黏蛋白(N-cadherin)多克隆抗体、兔抗波形蛋白(Vimentin)多克隆抗体、兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)多克隆抗体、链霉亲和素标记的山羊抗兔二抗，均为美国Proteintech公司生产。

仪器Epoch 2酶标仪，美国BioTek公司产品；BX51型倒置荧光显微镜，日本Olympus公司产品；QuantStudioTM 5 实时 PCR 系统，美国Thermo公司产品；Mini-PROTEANTMTetra蛋白电泳仪、Gel DocTM EZ型化学发光成像系统，均为美国Bio-Rad公司产品。

2 实验方法

2.1 细胞培养

SK-N-AS和SK-N-DZ细胞培养于含10%胎牛血清和1%双抗(100 U·mL-1青霉素；0.1 mg·mL-1链霉素)的DMEM培养基中，37 ℃,5% CO2恒温培养箱中培养。

2.2 CCK-8实验检测细胞活性

取对数生长期的SK-N-AS和SK-N-DZ细胞，按照每孔100 μL 含5 × 103个细胞，接种于96孔板，待细胞贴壁后，弃去原培养液，分别加入0.05、0.10、0.25、0.50、1.00和1.50 mg·mL-1苦参碱，继续培养24、48和72 h后，每孔加入CCK-8试剂10 μL,再培养2 h后，置酶标仪于450 nm波长检测每孔光密度(optical density, OD)值，分析存活率，并计算苦参碱作用上述2种细胞48 h的半数抑制浓度(half-inhibitory concentration, IC50),作为后续干预条件。

2.3 细胞分组与处理方法

实验分为AS实验组(SK-N-AS细胞给予IC50浓度苦参碱)、AS空白组(SK-N-AS细胞正常培养)、AS对照组(SK-N-AS细胞加入等量二甲基亚砜处理)和DZ实验组(SK-N-DZ细胞给予IC50浓度苦参碱)、DZ空白组(SK-N-DZ细胞正常培养)、DZ对照组(SK-N-DZ细胞加入等量二甲基亚砜处理),处理时间为48 h。

2.4 划痕实验检测细胞迁移能力

按照“2.3”的方法进行处理，将各组细胞传代至六孔板，待细胞汇合度达到95%时，用200 μL枪头垂直在板底部划出一条2 mm宽的划痕，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)清洗3次，用倒置荧光显微镜拍照，Image-pro-plus软件分析苦参碱作用48h后的划痕宽度，计算细胞迁移百分率，细胞迁移百分率 =(0 h时划痕距离 - 48 h时划痕距离)/0 h时划痕距离×100%[5]。

2.5 Transwell实验检测细胞侵袭能力

将0.5% Magtrigel基质胶100μL 铺在Transwell小室于37 ℃孵育过夜，按照“2.3”的方法分组，次日取各组细胞，用无血清培养基将细胞数调整为每毫升1 × 10 5个，取细胞悬液200 μL加入上室中，下室中加入10%胎牛血清的DMEM培养基500 μL。37 ℃继续培养24 h, 弃去培养液，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定30 min, 风干后，0.1%结晶紫染色15 min, 用棉签小心拭去上室中的细胞，PBS清洗3次，倒置显微镜下随机取5个视野计数穿膜细胞数，取平均值进行统计分析[5]。

2.6 qPCR检测E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的mRNA表达水平

按照‘2.3’的方法进行处理，提取细胞总RNA,按照说明书方法逆转录获得cDNA,进一步行PCR扩增。PCR反应条件：预变性(95 ℃,5 min);变性(95 ℃,10 s),退火(最适温度，30 s),延伸(72 ℃,50 s);40 个循环；保持4 ℃。以GAPDH为内参，用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平[6]。

2.7 蛋白质印迹(Western blot)法检测E-cadhe-rin, N-cadherin和Vimentin的蛋白相对表达水平

按照‘2.3’的方法进行处理。RIPA裂解细胞提取细胞总蛋白，BCA法测蛋白浓度。以蛋白30 μg按参考文献[6]方法进行电泳、转膜、封闭和杂交。用Quantity One软件进行OD值分析，蛋白表达以目的蛋白OD值与GAPDH OD值比值表示。

3 统计学处理

用SPSS 18.0软件进行统计分析。计量资料用

表示，多组间比较用方差分析，组间两两比较用t 检验。

二、结果

1 苦参碱抑制神经母细胞瘤细胞增殖

不同浓度(0、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、1.50 mg·mL-1)苦参碱，分别作用SK-N-AS和SK-N-DZ细胞24、48和72 h后，CCK-8结果显示，随着苦参碱浓度的升高和作用时间的增加，细胞生存率呈不同程度下降(表1),表明苦参碱抑制SK-N-AS和SK-N-DZ细胞增殖具有剂量和时间依赖性。苦参碱作用上述2种细胞48 h的IC50分别为0.6 mg·mL-1和1.0 mg·mL-1,该浓度用于后续实验。

2 苦参碱抑制神经母细胞瘤细胞迁移

苦参碱作用SK-N-AS细胞48 h后、AS空白组，AS对照组和AS实验组细胞迁移百分率分别为(66.32±3.12)%、(65.27±3.44)%和(23.73±0.79)%,AS实验组与AS空白组比较，在统计学上差异有统计学意义(P<0.001);苦参碱作用SK-N-DZ细胞48 h后，DZ空白组、DZ对照组和DZ实验组的迁移百分率分别为(46.25±4.68)%、(44.15±5.60)%和(16.77±3.52)%,DZ实验组与DZ空白组比较，在统计学上差异有统计学意义(P<0.001)。

表1 不同浓度苦参碱作用不同时间对神经母细胞瘤细胞生存率的影响

3 苦参碱抑制神经母细胞瘤细胞侵袭

苦参碱作用SK-N-AS细胞24 h后，AS空白组、AS对照组和AS实验组的侵袭细胞数分别为(870.45±19.32)、(865.32±23.39)和(492.74±16.81)个，AS实验组与AS空白组比较，在统计学上差异有统计学意义(P<0.001);苦参碱作用SK-N-DZ细胞24 h后，DZ空白组、DZ对照组和DZ实验组的侵袭细胞数分别为(1 198.10±43.71)、(1 203.03±71.91)和(891.69±42.62)个，DZ实验组与DZ空白组比较，在统计学上差异有统计学意义(P<0.001),见图1。

4 苦参碱对神经母细胞瘤细胞EMT相关分子mRNA表达的影响

各实验组干预48 h后，AS实验组E-cadherin、N-cadherin和Vimentin mRNA相对表达水平与AS空白组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.01);DZ实验组E-cadherin、N-cadherin和Vimentin mRNA相对表达水平与DZ空白组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.01),见表2。

图1 苦参碱对神经母细胞瘤细胞侵袭能力的影响(×100)

表2 苦参碱对神经母细胞瘤细胞上皮间质转化(EMT)相关分子mRNA表达的影响

5 苦参碱对E-cadherin、N-cadherin和Vimentin 蛋白表达的影响

与AS空白组比较，AS实验组E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平，在统计学上差异均有统计学意义(P<0.001、P<0.01和P<0.01);与DZ空白组比较，DZ实验组E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达，在统计学上差异均有统计学意义(P<0.01、P<0.001),见表3。

表3 苦参碱调控神经母细胞瘤细胞EMT相关蛋白表达的影响

三、讨论

肿瘤细胞的生长不仅依赖于其的快速增殖，还取决于其的侵袭和迁移能力。近期研究发现，

苦参碱能够抑制多种肿瘤细胞的增殖、侵袭与转移能力，如通过下调丝裂原活化蛋白激酶1/2信号通路抑制HepG2细胞的增殖和迁移[7];通过circFUT8/miR-944/YES1调控非小细胞肺癌的增殖、迁移和侵袭[5];调节circ_0027345/miR-345-5p/HOXD3轴抑制肝癌细胞的生长、迁移和侵袭，促进肝癌细胞凋亡和自噬[8]。本研究结果发现，苦参碱除了抑制神经母细胞瘤细胞的增殖外，还能抑制神经母细胞瘤细胞的迁移和侵袭。这些结果提示，苦参碱对神经母细胞瘤细胞同样具有抑制其增殖、迁移和侵袭能力的作用。

本研究不仅证实苦参碱在体外对神经母细胞瘤具有抑制其增殖、迁移和侵袭的抗肿瘤效应，而且对其潜在的分子机制进行了初步探讨。EMT是具有极性的上皮细胞转化为运动性较强的间质细胞的过程，其中E-cadherin表达减少和缺失可导致上皮细胞极性消失，细胞黏附性降低，是EMT的一个重要指标；同时伴随间充质细胞标志物N-cadherin和Vimentine的表达增加，导致EMT发生，被认为是转移起始的关键事件。据报道，EMT进程在神经母细胞瘤的快速进展和转移中发挥着重要作用[9]。本研究结果发现，苦参碱作用于SK-N-AS和SK-N-DZ细胞，可以促进上皮细胞特征分子E-cadherin表达显著增高，同时间质细胞特征分子N-cadherin和Vimentin 的表达显著下降，这些结果表明苦参碱对神经母细胞瘤的抗肿瘤效应与其抑制EMT进程密切相关。

基金资助:重庆市科卫联合基金资助项目(2019ZY023126); 重庆市中青年高端人才基金资助项目(202129); 重庆市研究生科研创新基金资助项目(CYB19154);

文章来源:刘南京,王冬娟,刘方杰,等.苦参碱对神经母细胞瘤细胞增殖､迁移和侵袭的影响[J].中国临床药理学杂志,2024,40(14):2048-2052.