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吗啡预处理对缺氧/复氧诱发的心肌细胞线粒体动力学变化的影响

2024-07-19 52 上传者：管理员

摘要：目的探讨吗啡（Mor）对缺氧/复氧（H/R）诱发的心肌H9c2细胞线粒体动力学变化的影响。方法将心肌H9c2细胞分为空白组（正常培养）、模型组（H/R处理）、对照组(5μmol·L-1 Mor处理)、实验组(H/R+5μmol·L-1 Mor处理)。用透射电子显微镜（TEM）观察线粒体的形态，用活性氧（ROS）、四甲基罗丹明乙酯（TMRE）、线粒体复合体Ⅰ和Ⅲ活性检测试剂盒分别检测ROS含量、线粒体膜电位（MMP）、复合体Ⅰ和Ⅲ活性，用蛋白质印迹法检测线粒体动力学相关蛋白GTP酶动力蛋白相关蛋白1（Drp1）、细胞色素氧化酶Ⅳ亚型（COXⅣ）和线粒体外膜转位酶20（TOM20）蛋白的表达水平。结果实验组细胞核膜光滑完整，线粒体大小一致，嵴排列整齐，空泡化减少，线粒体基质电子密度增加，自噬体数量减少。空白组、模型组、对照组和实验组细胞的ROS含量分别为1.03±0.04、1.53±0.10、1.06±0.06和1.10±0.11,MMP分别为1.00±0.15、0.80±0.16、1.06±0.19和1.00±0.19,复合体Ⅰ活性分别为1.00±0.08、2.28±0.82、1.05±0.26和1.13±0.37,复合体Ⅲ活性分别为1.00±0.09、2.13±0.38、0.83±0.22和0.96±0.11,Drp1蛋白相对表达水平分别为1.00±0.14、1.27±0.07、0.97±0.21和0.93±0.17,线粒体裂变蛋白1（Fis1）蛋白相对表达水平分别为1.00±0.16、1.33±0.18、1.17±0.25和0.99±0.05,COXⅣ蛋白相对表达水平分别为1.00±0.25、0.62±0.08、0.79±0.26和0.97±0.16,TOM20蛋白相对表达水平分别为1.00±0.13、0.67±0.15、0.75±0.13和0.89±0.05。模型组的上述指标与空白组比较，在统计学上差异均有统计学意义（P<0.05,P<0.01,P<0.001,P<0.000 1）;实验组的上述指标与模型组比较，在统计学上差异均有统计学意义（P<0.05,P<0.01,P<0.001,P<0.000 1）。结论吗啡可能通过抑制心肌线粒体自噬和分裂，以及降低呼吸链复合体Ⅰ和Ⅲ的活性减轻氧化应激损伤，进而维持线粒体动力学稳态，减轻H/R诱发的心肌细胞损伤。

关键词：
Mor
吗啡
心肌缺氧/复氧损伤
活性氧
线粒体动力学
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吗啡(morphine, Mor)用于治疗急性心肌梗死已有数十年之久[1]。既往研究证明，吗啡激活δ-阿片受体/表皮生长因子受体/活性氧(reactive oxygen species, ROS)信号途径，可减轻再灌注诱发的心肌损伤[2]。线粒体动力学稳态是目前抗心肌缺血再灌注损伤的研究热点之一。本研究旨在探讨吗啡对缺氧/复氧(hypoxia/re-oxygenation, H/R)诱发的心肌细胞线粒体动力学变化的影响。

一、材料与方法

1 材料

细胞大鼠心肌细胞系H9c2,购自美国ATCC细胞库。

药品与试剂盐酸吗啡注射液，规格：每支1 mL/10 mg, 批号：210510,批准文号：国药准字H21022436,东北制药集团沈阳第一制药有限公司生产。线粒体复合体Ⅰ和Ⅲ检测试剂盒，购自北京博奥森生物技术有限公司；增强型化学发光(enhanced chemiluminescence, ECL)试剂、蛋白浓度测定试剂盒(bicinchoninic acid, BCA)、细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)、四甲基罗丹明乙酯(tetramethylrhodamine ethyl ester, TMRE)检测试剂盒、活性氧(reactive oxygen, ROS)检测试剂盒、视神经萎缩蛋白(optic atrophy 1,OPA1)、线粒体裂变蛋白1(fission protein 1,Fis1)、线粒体外膜转位酶20(transporters of the outer mitochondrial membrane, TOM20)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔免疫球蛋白G抗体，均购自碧云天生物技术有限公司；GTP酶动力蛋白相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)抗体，购自英国Abcam公司；抗体丝裂融合蛋白2(mitofusin 2,Mfn2)、细胞色素C氧化酶Ⅳ亚型(cytochrome C oxidase Ⅳ,COX Ⅳ)和β微管蛋白(β-Tubulin),均购自美国Cell Signaling Technology。

仪器1658000电泳转膜装置、1658001凝胶成像仪，均为美国BIO-RAD公司产品；SpectraMax M3多功能酶标仪，美国Molecular Devices产品。

2 实验方法

2.1 细胞培养

将H9c2细胞培养于含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的Dulbecco’s modified eagle medium培养基(DMEM)中，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞密度达到80%,用0.25%胰蛋白酶消化，传代培养或冻存备用。

2.2 分光光度法测定细胞活力[3]3]

细胞以每孔5 000个的密度接种，进行浓度依赖性实验。缺氧阶段：空白组和对照组加入标准台式溶液(140 mmol·L-1 NaCl, 6 mmol·L-1 KCl, 1 mmol·L-1 MgCl2,1 mmol·L-1 CaCl2,5 mmol·L-1 HEPES和5.8 mmol·L-1葡萄糖),模型组和实验组中加入模拟缺血的溶液(含有10 mmol·L-1 2-脱氧-D-葡萄糖和10 mmol·L-1连二亚硫酸钠的台式溶液)30 min, 同时密封；复氧阶段：空白组和模型组加入台式溶液，实验组和对照组加入含Mor(1、5、10、50、100和0 μmol·L-1 Mor)的台式溶液30 min, 密度达到70%,磷酸盐缓冲液清洗，加入含10% CCK-8的DMEM培养基，37 ℃培养1 h, 于450 nm波长下检测光密度(optical density, OD)值。细胞存活率=OD处理孔-OD空白孔/OD对照孔-OD空白孔,根据结果选择合适的Mor浓度。

2.3 细胞分组及处置方法[2]2]

细胞密度达到70%,先缺氧30 min, 再复氧30 min(空白组和模型组加入台式溶液，实验组和对照组加入含5 μmol·L-1 Mor的台式溶液),培养，具体操作步骤见“2.2”。

2.4 透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM)测定线粒体形态及结构

按照“2.3”处理，收集细胞沉淀，注入2%～4%戊二醛固定液(pH 7.4);按常规TEM样品制备方法依次处理样本；切片、染色，TEM观察并记录。

2.5 分光光度法测定线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)[4]4]

按照“2.3”处理后，每孔添加TMRE工作液100 μL,37 ℃孵育30 min后，弃去孔内液体，每孔加入磷酸盐缓冲液100 μL,多功能酶标仪设置激发波长为550 nm, 发射波长为575 nm后检测OD值。

2.6 分光光度法测定ROS水平[3]3]

取对数生长期的细胞，以每孔1.5×105个的密度接种于6孔板中，每孔3 mL。待细胞密度达到80%左右时，每孔加入DCFH-DA工作液2 mL,孵育20 min, 按照“2.3”处理后，将细胞悬液按每孔100 μL接种到96孔板中，多功能酶标仪设置激发波长为488 nm, 发射波长为525 nm后检测OD值。

2.7 分光光度法测定线粒体复合体Ⅰ和Ⅲ活性

各组按照“2.3”处理，按说明书进行实验，对应测定340 nm和550 nm处OD值并记录，计算复合体活性。

2.8 蛋白质印迹法检测蛋白的表达水平[5]5]

加入裂解液，提取各组细胞总蛋白，BCA测定浓度后，进行SDS凝胶电泳和转膜，10%脱脂奶粉室温封闭，洗膜3次，4 ℃孵育一抗过夜，洗膜3次，室温孵育二抗，洗膜3次，在凝胶成像仪上曝光，并用Image J软件对条带进行灰度值分析，记录数据并进行统计分析。

3 统计学分析

用SPSS 23.0软件进行统计分析。计量资料以x¯±s

表示，2组样本比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)。

二、结果

1 不同浓度Mor对H9c2心肌细胞存活率的影响

不同浓度Mor(0、1、5、10、50、100 μmol·L-1)细胞存活率分别为1.00±0.08、1.00±0.12、0.96±0.06、1.00±0.14、0.96±0.10和0.91±0.09;H/R处理后，给予不同浓度Mor(0、1、5、10、50、100 μmol·L-1)细胞存活率分别为0.63±0.11、0.74±0.11、1.01±0.14、0.77±0.07、0.91±0.11和0.77±0.18。说明Mor对H9c2细胞无毒性作用，故选择5 μmol·L-1 Mor进行后续实验。

2 Mor对细胞线粒体形态及结构的影响

如图1所示，空白组细胞核膜光滑完整，线粒体大小一致，形态规则，基质电子密度较高；模型组细胞核膜发生皱缩，出现多形变化，核仁数量增加，线粒体数量减少，线粒体发生肿胀，嵴排列紊乱甚至消失，基质电子密度降低，可见自噬体分布；与模型组比较，实验组细胞核膜光滑完整，线粒体大小一致，嵴排列整齐，少数线粒体嵴出现空泡化，基质电子密度增加，自噬体数量减少；对照组细胞核膜光滑完整，线粒体大小一致，形态规则。

图1 用透射电子显微镜观察4组细胞线粒体的形态及结构变化(×8 000)

表1 缺氧/复氧(H/R)后吗啡(Mor)对线粒体动力学相关蛋白表达的影响(x¯±s)

表2 H/R后Mor对线粒体复合体Ⅰ和Ⅲ活性的影响(x¯±s)

3 Mor对MMP、ROS水平的影响

空白组、模型组、对照组和实验组的MMP水平分别为1.00±0.15、0.80±0.16、1.06±0.19和1.00±0.19,ROS水平分别为1.03±0.04、1.53±0.10、1.06±0.06和1.10±0.11。模型组与空白组比较，MMP水平显著降低，ROS水平显著升高(均P<0.000 1);实验组与模型组比较，MMP水平显著升高，ROS水平显著降低(均P<0.000 1)。

4 Mor对线粒体动力学蛋白表达的影响

如表1所示，模型组与空白组比较，Drp1和Fis1蛋白表达水平均显著增加(均P<0.05),COX Ⅳ和TOM20的蛋白表达水平均显著降低(P<0.05,P<0.001),Mfn2和OPA1的蛋白表达均无显著性差异(均P>0.05);实验组与模型组比较，Drp1和Fis1蛋白表达水平均显著降低(P<0.01,P<0.05),COX Ⅳ和TOM20的蛋白表达水平均显著增加(均P<0.05),Mfn2和OPA1的蛋白表达水平比较，在统计学上差异均无统计学意义(均P>0.05)。

5 Mor对线粒体复合体Ⅰ和Ⅲ活性的影响

如表2所示，模型组与空白组比较，线粒体复合体Ⅰ和Ⅲ活性均显著增加(均P<0.000 1);实验组与模型组比较，线粒体复合体Ⅰ和Ⅲ活性均显著降低(P<0.001,P<0.000 1)。

三、讨论

研究发现，维持线粒体稳态，减轻线粒体损伤，能够有效保护再灌注诱发的心肌损伤[6]。Drp1从胞质被募集到线粒体外膜并在线粒体分裂位点与Fis1等受体结合，导致线粒体碎片化[7]。位于线粒体外膜的Mfn1/2和内膜的OPA1则介导线粒体融合[8]。本研究中，模型组Drp1和Fis1的蛋白显著表达水平均较空白组显著增加，OPA1和Mfn2蛋白表达没有发生显著变化，而Mor抑制了Drp1和Fis1蛋白表达，提示Mor对H/R诱发的心肌细胞线粒体分裂具有抑制作用。

线粒体外膜的TOM20合成受阻提示线粒体损伤[9]。本研究中，模型组与空白组比较，COX Ⅳ和TOM20蛋白表达水平均显著降低，而Mor可使其蛋白表达上升。TEM发现，模型组肿胀线粒体增多，线粒体嵴消失，可见自噬体结构，但其可被Mor所逆转，并且Mor能够减轻H/R诱发的心肌细胞MMP降低，表明Mor不仅通过抑制线粒体自噬增加了心肌细胞线粒体的数量，同时也有助于线粒体质量的提高，进一步维持线粒体的动态平衡。在各种应激条件下，线粒体动态平衡改变时，带来ROS的爆发，造成组织器官的氧化应激损伤[10]。本研究证实在H/R时，细胞ROS含量以及复合体Ⅰ和Ⅲ的活性均显著上升，均可被Mor所逆转，提示Mor可能通过抑制呼吸链复合体Ⅰ和Ⅲ的活性，减少ROS的产生，从而减轻线粒体氧化应激损伤，维持线粒体稳态。

本研究提示：Mor可能通过抑制心肌细胞线粒体自噬和分裂，以及降低呼吸链复合体Ⅰ和Ⅲ的活性，减轻氧化应激损伤，进而维持线粒体动力学稳态，从而减轻H/R诱发的心肌细胞损伤。

参考文献:

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[3]刘子馨,辛高杰,尤越,等.基于线粒体分裂融合探讨丹酚酸B保护H9C2细胞OGD/R损伤的作用机制研究 [J].药学学报,2024,59(2):374—381.

[5]张艳,廖小婷,孙菡阳,等.miR-19b通过调节线粒体功能抑制H2O2诱导H9c2心肌细胞凋亡 [J].武汉大学学报(医学版),2023,44(7):787—792,823.

[6]宋元秀,崔鸣.线粒体动力学异常与相关心血管疾病 [J].心血管病学进展,2021,42(2):162—166.

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[10]刘俊蓉,周琛婓,王晓鹏,等.运动预干预对心肌缺血/再灌注大鼠心肌氧化应激及线粒体融合和分裂的影响 [J].山东体育学院学报,2023,39(4):91—99.

文章来源:高亚云,王蕴琦,张熙,等.吗啡预处理对缺氧/复氧诱发的心肌细胞线粒体动力学变化的影响[J].中国临床药理学杂志,2024,40(14):2023-2027.