蝶豆(Clitoria ternatea Linn.)，俗称蓝蝴蝶，以其鲜艳的蓝色花朵和蝴蝶状的花形成为全球知名的观赏植物。除了其在装饰和天然着色剂方面的广泛应用，蝶豆亦因其药用潜力而受到科研关注。现有研究揭示了蝶豆提取物(Clitoria ternatea Linn.extract,CTE)在抗炎、镇痛、抗癌以及抗真菌方面的多重药理作用(Maneesai et al.,2021;Maneesai et al.,2022;Yolin Angel et al.,2024)。特别是其在调节心血管功能和缓解氧化应激方面的成效，与其丰富的黄酮类化合物密切相关(Nair et al.,2015)。此外，传统医学视蝶豆为治疗神经系统疾病和增强认知功能的植物(Taranalli and Cheeramkuzhy,2000;Rai et al.,2005;Damodaran et al.,2020)，然而，蝶豆在现代医学中的应用价值仍待深入挖掘。

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一种以运动障碍为主要特征的神经退行性疾病，典型症状包括肌肉僵硬、运动迟缓和姿势不稳定(Bloem et al.,2021)。PD的发病机理涉及黑质-纹状体回路中多巴胺能神经元的变性和α突触核蛋白路易体的聚集(Wei et al.,2019;Chia et al.,2020;Elsworth,2020)。随着全球人口老龄化，PD患者数量日益增多，给患者及其家庭带来沉重的经济和心理负担(Ren et al.,2019)。PD的进展涉及多种细胞途径，包括线粒体功能障碍、氧化应激、神经炎症以及内质网应激(Jankovic and Tan,2020;Pajares et al.,2020)。Nrf2通路在抵御氧化应激中起核心作用，而NF-κB通路则在炎症反应中发挥主要作用，两者被视为PD治疗的潜在靶点(Huang et al.,2018;Fão et al.,2019;Arab et al.,2021)。

尽管PD尚无根治之法，蝶豆提取物的抗氧化、抗炎和神经保护特性(Damodaran et al.,2018;Singh et al.,2018;Kalmankar et al.,2021;Maneesai et al.,2021;Wang et al.,2022)及适度运动对神经再生和认知功能的益处(Xu et al.,2019)，为开发新的治疗策略提供了希望。本研究的目的是探索蝶豆提取物联合运动对PD模型大鼠的神经保护效应及其作用机制，以期为PD的综合治疗提供新的视角和实验依据。

1、结果与分析

1.1 蝶豆提取物与运动联合干预对帕金森病模型大鼠行为学的影响

在旋转行为学和自主活动的评估中(图1)，与正常对照组(NC)相比，帕金森病模型组(PD)的大鼠表现出显著增加的旋转次数和减少的自主活动距离(P<0.05)，揭示出运动功能障碍的特征。当引入运动(E组)和不同浓度的蝶豆提取物(L-CTE组,M-CTE组,H-CTE组)进行治疗时，这些症状得到了明显缓解，旋转次数显著减少，自主活动距离显著增加(P<0.05)，表明单一治疗策略已对PD大鼠的行为学缺陷产生正面效应。

值得注意的是，运动与高剂量蝶豆提取物的联合干预组(E+H-CTE组)在减少旋转次数和增加自主活动距离方面，不仅相比于PD组表现出更显著的改善(P<0.05)，也比单独运动组(E组)和单独高剂量蝶豆提取物组(H-CTE组)表现出更优越的效果(P<0.05)。这一发现揭示了蝶豆提取物与运动联合干预在减轻PD大鼠运动症状方面的潜在协同作用。

图1 蝶豆提取物联合运动对PD大鼠旋转行为学和自主活动的影响

1.2 蝶豆提取物与运动联合干预对帕金森病模型大鼠中脑形态的影响

通过HE染色对大鼠中脑组织形态学进行分析，发现在正常对照组(NC)中，大鼠的中脑细胞结构清晰，细胞核显示出正常形态(图2)。相比之下，帕金森病模型组(PD)的大鼠中脑显现出明显的病理变化，包括细胞核的显著皱缩和细胞质的透明变性。而在接受蝶豆提取物、运动以及它们联合干预的各治疗组中(E,L-CTE,M-CTE,H-CTE以及E+H-CTE)，这些病理特征有所减轻，特别是在高剂量蝶豆提取物联合运动的组别(E+H-CTE)中，细胞核皱缩和细胞透明变性的现象极为少见。这一结果表明，蝶豆提取物与运动的联合干预对缓解PD大鼠中脑的神经损伤具有显著效果。

图2 蝶豆提取物联合运动对PD大鼠中脑形态的影响

1.3 蝶豆提取物联合运动对PD大鼠中脑TH和α-Syn表达的影响

通过对免疫组化染色结果的分析(图3)，我们观察到在PD模型大鼠中，相比于正常对照组(NC组)，中脑组织中酪氨酸羟化酶(TH)的阳性表达显著减少，而α-突触核蛋白(α-Syn)的阳性表达则显著上升(P<0.05)，揭示了PD状况下神经元的损伤。

在接受蝶豆提取物和运动治疗的各个实验组(E组、低剂量CTE组(L-CTE组)、中剂量CTE组(M-CTE组)、高剂量CTE组(H-CTE组)及运动联合高剂量CTE组(E+H-CTE组)中，TH的阳性表达相比NC组有所增加，而α-Syn的阳性表达则相比PD组有所减少(P<0.05)，表明蝶豆提取物和运动对PD大鼠的神经保护作用。

特别是在运动联合高剂量CTE治疗组(E+H-CTE组)中，相较于仅运动组(E组)及仅高剂量CTE组(H-CTE组)，TH的阳性表达更为显著地增加，α-Syn的阳性表达则更为显著地降低(P<0.05)。这一结果表明，蝶豆提取物联合运动不仅单独提高了PD大鼠中脑中TH的表达水平，还协同作用于降低α-Syn的表达，从而可能发挥出更加有效的神经保护作用。

1.4 蝶豆提取物联合运动对PD大鼠中脑氧化应激的影响

本研究评估了蝶豆提取物与运动对PD模型大鼠中脑抗氧化酶活性的共同影响。结果显示(图4)，与正常对照组(NC组)相比，PD模型组大鼠的中脑超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活性显著下降，而丙二醛(MDA)的活性显著上升(P<0.05)，提示了PD组中氧化应激水平的升高。

在进行了运动(E组)、低剂量蝶豆提取物(L-CTE组)、中剂量蝶豆提取物(M-CTE组)、高剂量蝶豆提取物(H-CTE组)和运动结合高剂量蝶豆提取物(E+H-CTE组)干预后，各治疗组大鼠的中脑SOD、CAT和GSH-PX活性较NC组有所增加，MDA活性则较PD组有所降低(P<0.05)，这一结果表明蝶豆提取物及运动干预均能增强中脑的抗氧化防御机制。

在E+H-CTE组中，中脑SOD、CAT和GSH-PX的活性不仅相较于单独的E组和H-CTE组有显著提高，MDA活性也有显著下降(P<0.05)。这一综合干预效果表明，蝶豆提取物联合运动能显著上调PD大鼠中脑的抗氧化能力，这可能对减轻PD相关的氧化应激损伤具有重要意义。

图3 蝶豆提取物联合运动对PD大鼠中脑TH和α-Syn表达的影响

1.5 蝶豆提取物与运动协同作用对帕金森病大鼠中脑炎症的调节

在本研究中，我们测定了帕金森病(PD)模型大鼠中脑区炎症标志物的水平。数据分析(图5)表明，与正常对照组(NC组)相比，PD组大鼠中脑组织中肿瘤坏死因子α (TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素6 (IL-6）的表达水平显著升高(P<0.05)，这一结果使得PD状态下的神经炎症加剧。

相比之下，仅接受运动治疗的组(E组)、低剂量蝶豆提取物组(L-CTE组)、中剂量蝶豆提取物组(M-CTE组)、高剂量蝶豆提取物组(H-CTE组)以及运动联合高剂量蝶豆提取物组(E+H-CTE组)在TNF-α、IL-1β和IL-6的表达上均较PD组显著降低(P<0.05)。更值得注意的是，E+H-CTE组的中脑炎症标志物水平相较于单独的运动组(E组)和单独的高剂量蝶豆提取物组(H-CTE组)均显著降低(P<0.05)。

这些结果表明，蝶豆提取物与运动的结合不仅可以减轻PD模型大鼠的中脑炎症水平，且联合应用时的效果优于任何单一治疗策略。这支持了蝶豆提取物和运动在缓解PD相关神经炎症中的协同作用假设，并为后续的临床研究提供了理论基础。

1.6 蝶豆提取物联合运动对PD大鼠中脑Nrf2和NF-κB活化的影响

通过Western blot分析发现，与正常对照组(NC)相比，帕金森病模型组(PD)的大鼠中脑中Nrf2蛋白在细胞核内的表达水平有所下降，而NF-κB的磷酸化水平则显著上升(P<0.05)(图6)，提示PD病理状态下Nrf2的抗氧化应激途径受到抑制，而与炎症相关的NF-κB途径被激活。

在接受运动训练(E组)、低剂量(L-CTE组)、中剂量(M-CTE组)和高剂量蝶豆提取物(H-CTE组)的PD大鼠中，细胞核内Nrf2蛋白的表达水平相对于PD组有所增加，而NF-κB的磷酸化水平则相对降低(P<0.05)(图6)，显示了运动和蝶豆提取物在不同程度上对中脑氧化应激和炎症反应的调节作用。

图4 蝶豆提取物联合运动对PD大鼠中脑氧化应激的影响

图5 蝶豆提取物联合运动对PD大鼠中脑炎症的影响

在运动与高剂量蝶豆提取物联合处理的E+H-CTE组中，细胞核Nrf2的表达水平不仅较PD组显著升高，而且也高于单独运动组或单独H-CTE组(P<0.05)(图6)。同时，该组别中NF-κB的磷酸化水平也低于E组和H-CTE组(P<0.05)(图6)。这些结果表明，蝶豆提取物与运动的联合干预有助于显著提升帕金森病模型大鼠中脑内的Nrf2活性，同时抑制NF-κB通路的活化，揭示了其协同增效的神经保护机制。

图6 蝶豆提取物联合运动对PD大鼠中脑Nrf2和NF-κB活化的影响

2、材料与方法

2.1 蝶豆提取物的提取及鉴定

蝶豆根首先在60℃下干燥24 h以除去水分，随后被研磨成粉。蝶豆根粉末随后以10倍体积的无水乙醇进行浸渍，持续72 h，此过程3次重复以确保充分提取。提取后，滤液被收集并合并，然后使用旋转蒸发器在减压条件下浓缩，以除去大部分乙醇。最后，所得浓缩物通过冷冻干燥机进行干燥，得到最终的粉末状提取物，并储存在-20℃下以保持稳定。按照提取物质量与原蝶豆根粉末质量的比例计算得率，整个提取过程的得率为12.00%。同时，使用色谱、质谱等现代分析手段对提取物中的主要成分进行定性和定量分析。根据分析结果与已知标准对照进行比对，确认提取物的化学成分，以确保其质量符合实验要求。

2.2 实验动物及PD模型的建立

本研究使用成年雄性Sprague Dawley大鼠，体重在200～250 g之间，这些大鼠均来源于上海交通大学医学院实验动物中心，持有有效生产许可[SCXK(沪)2023-0010]。实验选用的大鼠年龄为7至8周，以确保成熟度和生理状态的一致性。所有大鼠在一个受控的环境中饲养，条件设置为：恒温(22±2)℃、相对湿度(55±5)%，并且遵循12 h昼/12 h夜循环以模拟自然光周期。

PD大鼠模型的建立首先是通过戊巴比妥钠进行麻醉，以确保动物在接受手术时处于无痛状态。随后，大鼠被安置在脑立体定位仪上，进行精确的神经外科操作。通过颅顶正中线切开皮肤以暴露颅骨，以前囟为参考点，定位到黑质纹状体区的精确坐标，接着用颅钻在指定位置钻开颅骨。使用微量注射器(5μL)将8μg/4μL的6-羟基多巴胺(6-OHDA)慢慢注入目标区域，注射速度控制在1μL/min，确保药物分布均匀且减少周围组织的损伤。手术完成后，用生物相容性好的材料海绵填塞骨窗，并仔细缝合切口，以促进愈合。

在术后两周，使用0.5 mg/kg的盐酸阿扑吗啡通过诱导旋转行为来评估模型的建立效果。大鼠表现出每30 min旋转210次或以上的行为即视为模型建立成功，这表示黑质纹状体区域的多巴胺能神经元已受到显著损伤，为进一步的干预研究提供了基础。

2.3 实验动物分组和实验干预处理

本实验选用大鼠共计84只，随机分为7个实验组，每组12只。分组如下：正常对照组(NC组)、帕金森病模型组(PD组)、仅运动干预组(E组)、低剂量蝶豆提取物组(L-CTE组)、中剂量蝶豆提取物组(M-CTE组)、高剂量蝶豆提取物组(H-CTE组)以及高剂量蝶豆提取物联合运动干预组(E+H-CTE组)。NC组作为健康的对照，只接受0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液灌胃并正常饲养，不进行任何形式的模型建立或干预。PD模型建立在所有除NC组外的大鼠上，而PD组大鼠则除模型建立外未进行任何其他干预。

L-CTE组、M-CTE组和H-CTE组分别接受100、200和400 mg·kg-1·d-1的蝶豆提取物口服给药(Damodaran et al.,2020;Safhi et al.,2022)，并同样进行正常饲养。E组虽给予相同浓度的CMC-Na溶液，但同时配合有氧运动干预。E+H-CTE组则联合给予最高剂量的蝶豆提取物及有氧运动干预。

有氧运动实施于给药后2 h，使用跑步机(型号:ZH-PT/5Sm生产商:安徽正华)进行。运动方案在实验的第一周设置为每天30 min，速度依次为5、5、5、10和15 m/min。第2周至第8周，速度统一设定为15 m/min，且每天运动时间每周增加5 min，直至最长1 h。整个运动干预周期为每周5 d，持续8周。所有实验操作均遵循相关伦理规定，并努力减少动物的不适。

2.4 旋转行为学测试

在实验终点次日，进行了旋转行为学测试以评估诱导后的运动协调性。实验中，大鼠腹腔内注射0.5 mg/kg的盐酸阿扑吗啡，随即开始观察。在接下来的30 min内，精确记录了大鼠的旋转次数。为增强数据的可靠性，该测试共进行3次，并计算出平均旋转次数作为最终数据。

2.5 自主活动测试

自主活动测试旨在评估大鼠的探索性行为和运动功能。该测试使用了Panlab公司(西班牙)的红外线自主活动测试系统，配合Actitrack软件进行数据捕捉。实验操作中，将大鼠轻柔地置于活动箱中央，并连续记录30 min的活动距离。

2.6 中脑组织病理学检查

在无菌条件下取出大鼠中脑组织，并在4%的多聚甲醛溶液中浸泡过夜以固定组织。随后进行石蜡包埋，利用显微切片机获取4μm厚的切片。对获得的切片进行脱蜡和水化处理后，施行HE染色以评估中脑组织的形态变化。最终，样本在光学显微镜下进行观察和分析。

2.7 免疫组化染色

对于免疫组化染色，首先将石蜡切片进行脱蜡和水化。切片在3%的过氧化氢溶液中处理10 min以阻断内源性过氧化酶活性。随后，在抗原修复缓冲液中进行微波加热至95℃并维持10 min以暴露抗原位点。切片在5%的正常山羊血清中封闭10 min，随后添加酪氨酸羟化酶(TH)和α-突触核蛋白(α-Syn)抗体在4℃下孵育过夜。第2天，切片经生物素标记的二抗在37℃下处理30 min，并使用3,3'-二氨基联苯胺进行显色，最后以苏木精进行复染。阳性染色的百分比由Image J软件进行定量统计。

2.8 中脑组织氧化应激和炎症因子检测

大鼠中脑组织在生理盐水中洗涤后，被研磨成均质物。按照试剂盒的说明，测定了抗氧化酶(超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT和谷胱甘肽过氧化物酶GSH-PX)的活性和脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的水平。炎症因子(TNF-α,IL-1β和IL-6)的水平则通过酶联免疫吸附测定进行了评定。

2.9 蛋白质提取及Western blot分析

蛋白质从中脑组织中提取，首先使用富含蛋白酶抑制剂的冷RIPA缓冲液进行匀浆处理。随后，在4℃条件下，以12 000×g离心5 min以分离蛋白质，慎重地收集上清以获得清洁的蛋白样品。采用二辛可宁酸法准确测定样品中的蛋白质浓度。分离蛋白时，每个样品取50μg蛋白质负载于8%的SDS-PAGE凝胶中。蛋白质分离后，利用湿转印技术将之转移到聚偏氟乙烯膜上。

膜转移完成后，使用5%脱脂奶粉在室温下封闭2 h以阻塞非特异性结合位点。然后将膜与Nrf2、Lamin B1、NF-κB p65、p-NF-κB p65和β-actin的一抗在4℃条件下孵育过夜。一抗孵育后，膜被TBST缓冲液洗涤，继而在室温下与相应的二抗反应1.5 h。利用增强型化学发光法对蛋白条带进行检测，并使用Image软件进行条带强度的量化分析。以Lamin B1和β-actin作为核蛋白和总蛋白的内部对照标准。

2.10统计分析

所有数据均应用SPSS统计软件版本21.0进行分析。组间差异通过单因素方差分析(ANOVA)进行评估，并使用Tukey多重比较法进行事后检验，显著性水平设定为P<0.05。

3、讨论

本研究围绕蝶豆提取物在帕金森病(PD)治疗中的应用进行了探讨。蝶豆在传统医学中因其对神经系统的治疗作用而备受赞誉，更有研究表明其对提升认知功能具有潜力(Mukherjee et al.,2008)。已有研究证实，蝶豆提取物在多种药理活性上表现出色，如增强记忆、抗焦虑、抗抑郁以及抗炎等(Damodaran et al.,2018)。特别是在海马CA1区神经元保护及认知功能恢复方面的效果，预示了其成为血管性痴呆和阿尔茨海默病患者认知衰退预防的候选药物(Damo-daran et al.,2018;Damodaran et al.,2020)。然而，对于蝶豆提取物在PD治疗上的作用及其机制，之前的认知还相对有限。

在本次研究中，我们发现蝶豆提取物和运动不仅在行为学表现上对PD大鼠有改善作用，还对中脑细胞核的结构改变有显著的抗损伤效应。更为重要的是，蝶豆提取物与运动的联合干预显示出了协同效应，更为有效地减缓了PD症状和神经损伤。这一结果提示我们，将药物治疗与物理治疗结合，可能是一种提升PD治疗效果的有效策略。

PD作为一种年龄相关的中枢神经系统疾病，其主要病理标志为黑质-纹状体回路中多巴胺神经元的退行性变性及α-Syn包含的路易体持续积累(Michel et al.,2016;Michel et al.,2022;Nagatsu et al.,2022)。本研究中蝶豆提取物联合运动对中脑中多巴胺合成相关酶TH的表达增加和α-Syn表达的下调，表明其可能通过促进多巴胺神经元的存活来发挥作用。

氧化应激是PD发病过程中的关键因素(Tolosa et al.,2021;Weintraub et al.,2022)。我们的研究观察到，通过激活中脑Nrf2的表达，蝶豆提取物联合运动显著增强了抗氧化能力，从而可能有助于保护多巴胺神经元，减缓PD进展(Monir et al.,2020;Yang et al.,2022)。

神经炎症同样在PD神经退行性变化中发挥着关键角色(Wei et al.,2019)。NF-κB的激活与多种炎症中间体的上调密切相关，其在小胶质细胞和神经元中的表达与PD的发病机制有关(Singh et al.,2020;Gao et al.,2021)。运动被认为可以通过NF-κB通路改善记忆损伤(Kim et al.,2021)，而蝶豆提取物通过调节炎症介质的过度产生显示了其抗炎作用(Nair et al.,2015;Singh et al.,2018;Safhi et al.,2022)。本研究进一步证实了蝶豆提取物联合运动在抑制PD大鼠中脑NF-κB磷酸化和炎症响应方面的潜力。

总结以上发现，蝶豆提取物联合运动不仅减轻了PD症状，促进了多巴胺神经元存活，还激活了抗氧化系统，并抑制了炎症途径，为PD的防治提供了新的策略。本研究强化了蝶豆提取物联合运动作为一种潜在的防治PD手段的认识，为未来的临床研究和治疗应用提供理论依据。

文章来源:马勇.蝶豆提取物联合运动对帕金森病大鼠模型神经保护作用的研究[J].分子植物育种,2024,22(16):5492-5500.