乳腺增生(hyperplasia of mammary gland, HMG)是以乳腺导管扩张、乳腺小叶弥漫性增生等为主要特征及退行性改变的一种疾病[1]。乳腺增生的出现频次在全部乳腺问题中高达75%,它在乳腺问题中排名第一，同时也存在明显的癌症风险。相比于健康的女性，它的癌症风险高出2～4倍，这对患者的身体健康以及精神状态都带来了巨大的压力[2,3],因此，及时干预治疗，防止其癌变刻不容缓。目前西医治疗HMG多采用激素药、维生素或手术切除的方法，具有疗效不稳定、副作用大等特点，且对早期乳腺增生没有特效疗法[4,5]。在中医学中，HMG被归类为“乳痞”和“乳癖”的疾病类型。这是因为，女性的乳头代表肝脏，而乳房则代表胃部。因此，乳腺的问题与肝脏、胃部以及肾脏的精、冲任两脉有着紧密的联系。肝脏负责排泄，如果肝脏的气机不畅，排泄功能受阻，就有可能引发乳腺的问题[6]。因此，中医常采用具有疏肝养肾、补气血、健脾胃功效的中药进行治疗。

白术(atractylodes macrocephala Koidz.),是菊科植物白术的干燥根茎，其特性温和，具有增强脾胃等功效[7]。现代研究显示，白术富含苍术酮、白术内酯等多种化学物质，能够抗炎、抗氧化、抗肿瘤，同时还能够保护神经系统和肝脏等多种药理效应[8,9]。“柴胡-白术”这种药物可能通过切断PI3K/AKT/mTOR的途径，来阻止抗凋亡信号的传播，从而推动乳腺细胞的死亡，并起到抑制乳腺增生的效果。然而，目前对于白术治疗乳腺增生症的具体作用机制研究较少。本研究采用网络药理学方法，构建白术治疗乳腺增生症的有效成分、潜在靶点以及信号传导通路，进一步通过分子对接和动物实验，以期为揭示白术治疗乳腺增生的作用机制提供理论支持。

1、材料与方法

1.1 试剂与仪器

白术(批号：201001),购自佳木斯百草堂药行，经佳木斯大学药学院张宇教授鉴定为菊科植物白术干燥根茎。苯甲酸雌二醇、黄体酮注射液购自上海全宇生物科技动物药业有限公司；枸橼酸他莫昔芬片购自扬子江药业集团；其他试剂为分析纯。Morris水迷宫视频跟踪分析系统(成都泰盟科技有限公司);JJ-12J型脱水机、JB-L7型包埋机(武汉俊杰电子有限公司);RM2016型病理切片机(上海徕卡仪器有限公司);XSP-13C-LP型显微镜(上海精密仪器有限公司)。

1.2 动物

SD大鼠(SPF级)48只，雌性(200～220g),长春亿斯实验动物技术有限责任公司(许可证号：SCXK(吉)-2020-0002),SPF级动物室饲养，给予自然光照，维持室内卫生和食水新鲜。本研究经佳木斯大学实验动物中心伦理委员会审核通过(伦理批号：JMSU-242)。

1.3 白术治疗HMG的网络药理学研究

1.3.1 白术活性成分筛选及靶点预测

以“白术”为检索词，在TCMSP数据库，设置OB≥30%,DL≥0.18为筛选条件，获得活性成分，通过Swiss Target Prediction预测靶点。

1.3.2 疾病靶点及白术治疗HMG潜在靶点的获取

以"Hyperplasia of mammary gland"为检索词，在GeneCards和OMIM数据库，整合重复条目得到白术治疗HMG的交集靶点。

1.3.3 “药物-有效成分-潜在靶点”网络构建

将白术的活性成分和白术治疗HMG的潜在靶点输入Cytoscape3.7.1软件，建立"药物-有效成分-潜在靶点"的网络图。节点代表了靶点或化合物，连接的边描述药物、有效成分与乳腺增生症的相互影响。

1.3.4 PPI网络构建

将白术治疗HMG的潜在靶点输入String数据库，限定研究对象为人，设置最高等置信度(0.900),将无相互关联的节点隐藏，获得蛋白互作关系，使用Cytoscape 3.7.1可视化处理，建立PPI网络。

1.3.5 GO和KEGG富集分析

David数据库中的GO和KEGG富集分析被用于研究交集靶点，并将分析成果导入微生信平台可视化处理。

1.4 主要活性成分与关键靶点分子对接

使用AutoDock 4.2.6软件对筛选出的关键靶点与主要活性成分执行分子对接，验证活性成分与疾病靶点的结合效果。

1.5 药理实验

1.5.1 动物分组、造模及给药

选取雌性SD大鼠48只，适应性喂养7d, 随机分为6个小组：空白组、模型组、阳性药物组、白术水煎液高、中、低剂量组，每组8只。除空白组外，其余各组大鼠肌注苯甲酸雌二醇(0.5mg/kg·d),连续25d, 继而注射黄体酮5mg/kg·d, 连续5d达到建立疾病模型的目的，阳性药物组(他莫昔芬：4mg/kg),白术水煎液高、中、低剂量组(1.08、0.54、0.27g/kg),连续灌胃30d。

1.5.2 大鼠乳头直径检测

在末次给药24h后，将实验动物进行麻醉处理，用游标卡尺测定大鼠第二对乳头直径。

1.5.3 大鼠乳腺组织病理学观察

在末次给药24h后，对动物进行了麻醉并取出了第二对乳腺组织。用4%的多聚甲醛进行固定，通过HE染色法，×100显微镜下，进行图像收集和分析，观察其组织的病理变化。

1.5.4 ELISA法检测大鼠血清中E2、PRL含量

依据ELISA试剂盒指示进行操作，对每组大鼠的血液样本进行E2和PRL的浓度测定。

1.6 统计学方法

采用GraphPad 8.0软件进行统计学分析，使用单因素方差分析(One Way ANOVA)来进行组间比较，数据以均数±标准差

表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 白术治疗HMG的网络药理学研究结果

2.1.1 白术活性成分筛选及靶点预测结果

经TCMSP数据库和文献研究，总计获取了55个白术活性成分，并在筛选过程中确定了7个成分，包括α-香树脂醇、3β-乙酞氧基苍术酮以及白术内酯III等，见表1。预测得到89个作用靶点，包括PTGS2、ESR1、MAPK14等。

表1白术活性成分

2.1.2 疾病靶点及白术治疗HMG潜在靶点的获取结果

合并去重后共得到疾病靶点5373个，利用Venny 2.1将HMG靶点和白术靶点进行映射，共得到63个交集靶点，这些靶点可能为白术治疗HMG的潜在靶点，见图1。

图1 白术与HMG交集靶点Venn图

2.1.3 “药物-有效成分-潜在靶点”网络构建结果

使用Cytoscape 3.7.1软件对已获得的白术活性物质和其作为HMG治疗的目标进行了整合，构建了“药物-有效成分-潜在靶点”的关系网，见图2。由图可知，此网络共有68个节点，74条边，其中3β-乙酞氧基苍术酮、白术内酯III的度值较高，可能是白术治疗HMG的关键活性成分。

图2 白术治疗HMG的“药物-有效成分-潜在靶点”网络

2.1.4 PPI网络构建结果

对63个白术治疗HMG的潜在靶点进行蛋白质相互作用研究，绘制PPI网络，见图3。由图可知，PTGS2、ESR1、MAPK14、HMGCR、NR3C1等靶点位于网络的中心且度值较大，表明白术可能通过作用于这些关键靶点发挥治疗HMG作用。

图3 白术治疗HMG的PPI网络

图4 白术治疗HMG的GO富集分析

2.1.5 GO和KEGG富集分析结果

在DAVID数据库，进行GO和KEGG的富集分析。GO富集分析阶段，发现178个GO项(P<0.05),分别为生物过程100个，细胞组分29个和分子功能49个。DNA模板化转录的正调控是生物过程的核心，它揭示了白术有可能通过调整这些生物学步骤对疾病产生影响。此外，细胞成分主要包括质膜(plasma membrane),而分子功能主要包括类固醇的结合(steroid binding)以及锌离子的结合(zinc ion binding),见图4。

KEGG通道的富集分析结果显示，有24条信号通道(P<0.05),根据P值的高低进行了排列，最终形成了KEGG富集通路图，见图5。由图可知白术治疗HMG的主要代谢通路有VEGF信号通路、钙离子信号通路和催乳素信号通路等。

图5 白术治疗HMG的KEGG富集分析

2.2 主要活性成分与关键靶点分子对接结果

AutoDock 4.2.6软件对筛选出的主要活性成分白术内酯III、3β-乙酞氧基苍术酮等对目标蛋白PTGS2、ESR1、MAPK14、HMGCR进行了分子对接实验。通常来说，如果对接的结合能量<-5kcal·mol-1表明对接结果比较稳固，见表2、图6。

表2分子对接结果

图6 白术内酯III与PTGS2、MAPK14的分子对接2D图

2.3 药理实验结果

2.3.1 白术对HMG模型大鼠的乳头直径影响

相比空白组，模型组大鼠乳头直径显著升高(P<0.01);相比模型组，阳性药物组、白术水煎液高剂量组的乳头直径显著下降(P<0.01),白术水煎液中剂量组的乳头直径极显著下降(P<0.05),白术水煎液低剂量组的乳头直径下降不显著(P>0.05),见表3。

表3各组大鼠乳头直径比较

2.3.2 白术对HMG模型大鼠乳腺组织病理形态的作用

通过显微镜观察分析发现，空白组大鼠乳腺组织细胞的形状呈现出规律性，乳腺小叶内的腺泡数量较少，导管纤细没有出现增生性的病变和分泌物的存在。而模型组大鼠导管显著扩张，小叶内的腺泡紧密且大小不一，形状各异，并且含有分泌物。阳性药物组的小叶内的腺泡形状规则，导管呈纤细型态，且无分泌物。与模型组相比，白术水煎液的高、中、低剂量组大鼠乳腺病理改变均有一定程度的减轻，腺体数量下降，乳腺导管的扩充减缓，乳腺导管管腔分泌物也有所减少，其中白术水煎液高剂量组的效果最为突出，见图7。

图7 白术对HMG模型大鼠乳腺组织病理形态影响(HE×100)

2.3.3 大鼠血清中E2、PRL含量检测结果

相对于空白组，模型组的大鼠血清E2和PRL的数值有着非常明显的提升(P<0.01)。

当与模型组进行对比时，阳性药物组和白术水煎液的高剂量组的大鼠E2的数值极显著的下降(P<0.01),白术水煎液中剂量组显著降低(P<0.01),白术水煎液低剂量组PRL含量有所降低，但无显著性差异(P>0.05)。表明白术能够调节HMG大鼠的激素含量，见图8。

图8 白术水煎液对HMG大鼠血清中激素含量的影响

3、讨论

本研究利用“药物-有效成分-潜在靶点”的网格结构，找出了与乳腺增生有关的活性成分为3β-乙酞氧基苍术酮、白术内酯III等。陆家佳[10]研究表明苍术酮可在一定程度上抑制乳腺癌MCF-7细胞。白术内酯通过JNK/ERK-NRF2-ARE通路能够增强NRF2及其下游解毒酶的表达，从而抑制雌激素诱导的MCF10A细胞的恶性转化，并能抑制乳腺组织的炎症和氧化应激反应[11]。因此，白术可能通过活性成分3β-乙酞氧基苍术酮、白术内酯III等发挥抗HMG作用。

PPI网络分析表明，PTGS2、ESR1、MAPK14等度值较高，可能是白术治疗HMG的关键靶点。PTGS2又名COX-2,研究表明COX-2高表达可影响乳腺癌血管异常及淋巴结转移，下调COX-2水平，可抑制乳腺癌MCF-7细胞生长和增殖，达到治疗效果[12,13]。ESR为雌激素受体，参与靶细胞增殖、分化与稳态[14]。抑制MAPK信号通路，可以阻止通路中的ERK蛋白磷酸化，干扰信号转导，减轻乳腺增生的严重性。

GO和KEGG富集分析结果表明，白术可能通过调节VEGF信号通路、钙离子信号通路催乳素信号通路发挥抗HMG作用。抑阻断VEGF的信息传递途径，能够阻止乳腺的血管生长，进一步对HMG症产生治疗效果[15]。对于HMG的病人，血液中的钙离子含量会随着疾病的恶化而减少。当疾病变得更严重时，雌性激素的含量也会相应增加，这将导致钙离子的含量下降。因此，上调钙离子水平可改善疾病[16]。催乳素分泌过多，既可以抑制黄体期卵巢P的生成，也可以刺激E2的大规模生成，将导致E2/P的比例严重失衡，久之引起乳腺组织增生，抑制催乳素信号通路，降低血清中PRL水平，是治疗HMG症的有效途径[17]。因此，白术可能通过上调钙离子信号通路蛋白表达，抑制VEGF信号通路和催乳素信号通路发挥抗HMG作用。

在研究过程中，采用了苯甲酸雌二醇和黄体酮来诱导HMG大鼠模型进行体内试验。研究发现，白术水煎液能显著降低HMG模型大鼠乳头直径，HE组织切片染色显示，白术水煎液干预后，所有大鼠的乳腺病理状况都有所改善，腺体数量减少，乳腺导管扩张程度降低，乳腺导管管腔内的分泌物也有所减少。此外，ELISA实验结果显示，HMG大鼠血清中E2、PRL水平表达显著升高，给予白术水煎液干预后，大鼠血清中E2、PRL水平显著下降，恢复体内激素失衡，从而改善疾病。

综上所述，本研究利用网络药理学对白术治疗HMG的活性成分、核心靶点以及信号传导路径进行了初步预测，并通过分子对接和动物实验初步验证了白术对HMG的主要药效以及相应的作用原理，这将为阐明白术治疗HMG的药效物质提供依据，对临床运用中药治疗HMG具有指导意义。但本研究还存在以下不足，网络药理学所使用的数据库来自于不同的数据库和文献，这些数据来源可能存在不同程度的误差和偏差，因此网络药理学的分析结果具有一定的局限性。此外，对机制的研究不够深入，后续研究将进一步挖掘白术治疗HMG的其他作用机制。

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基金资助:黑龙江省大学生创新创业计划项目,编号:202210222135; 黑龙江省自然科学基金重点项目,编号:ZD2022H006; 黑龙江省自然基金联合项目,编号:LH2022H093; 黑龙江省教育厅基本科研业务费基础研究项目,编号:2022-KYYWF-0612;黑龙江省教育厅基本科研业务费基础研究项目,编号:2022-KYYWF-0616;

文章来源:李烁,王艳艳,厉昌旭,等.基于网络药理学和分子对接探究白术治疗乳腺增生的作用机制[J].黑龙江医药科学,2024,47(04):15-19+8.