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用UHPLC-MS/MS法测定大鼠血浆中L-辛弗林的浓度

2024-08-15 51 上传者：管理员

摘要：目的建立超高效液相串联三重四极杆质谱法测定大鼠血浆中L-辛弗林的方法，并应用于药代动力学研究。方法血浆样品用乙腈涡旋沉淀蛋白，离心，氮吹干后，用流动相溶解，进样分析。色谱柱：Shiseido CAPCELL PAK CR（1∶4）色谱柱（2.0 mm×150.0 mm, 5μm）,柱温：25℃;流动相：乙腈-0.1%甲酸溶液含10 mmoL·L-1甲酸铵（73∶27）;流速：0.3 mL·min-1;进样量：2μL。以电喷雾离子源电离，正离子多反应监测模式进行质谱检测，并按要求开展了生物样品方法学验证。L-辛弗林以5 mg·kg-1的剂量灌胃后，不同时间点采血，以考察L-辛弗林在大鼠体内的药代动力学特征。结果 L-辛弗林在2～800 ng·mL-1内呈现良好的线性关系，定量下限：2 ng·mL-1,精密度、提取回收率，基质效应、准确度、稀释效应、残留效应均符合要求。L-辛弗林的主要药代动力学参数：Cmax为（464.83±76.68）ng·L-1,tmax为（0.67±0.26）h,t1/2z为（1.89±0.48）h, AUC0-t为（602.27±42.25）ng·mL-1·h-1,AUC0-∞为（612.28±41.18）ng·mL-1·h-1。结论建立的液质联用测定大鼠血浆中L-辛弗林浓度的方法简单、快速，可用于血浆中L-辛弗林含量的测定。

关键词：
L-辛弗林
大鼠
药代动力学
血浆
超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法
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中药枳实具有多种生物活性，辛弗林为枳实中主要生物碱类活性成分[1]。L-辛弗林与肾上腺素相似，属于弱肾上腺素能激动药，主要通过β-肾上腺素能受体，刺激脂肪分解[2];同时，该成分还有改善糖尿病的作用[3]。近年来，在美国食品药品管理局禁止使用含麻黄碱的膳食补充剂后，国外以枳实提取物的形式使用L-辛弗林，被广泛运用于减肥保健食品膳食添加剂[4]。但L-辛弗林心脏不良事件偶有发生，包括心动过速、变异型心绞痛等药物不良反应[5-9]。基于L-辛弗林广泛的肾上腺能激动作用，有必要对其体内过程进行评估。本研究建立液质联用法测定大鼠血浆中L-辛弗林含量，以期为考察L-辛弗林药代动力学特性提供参考。

一、材料与方法

1 材料

动物SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠，鼠龄8周，体质量220～250 g, 购自长沙天勤生物技术有限公司。动物生产许可证号：SCXK(湘)2022-0011。本实验经江西省药品检验检测研究院实验动物伦理委员会批准(伦理批号：JXYJY-035-5-3-13)。

试剂L-辛弗林对照品，纯度：>98.0%,批号：QJ84H-XV,购自日本化成工业株式会社；盐酸麻黄碱对照品，纯度：99.8%,批号：171241-201508,购自中国食品药品检定研究院。

仪器API4000三重串联四极杆质谱仪、Analyst 1.6.3软件，均为美国AB SCIEX公司产品；Agilent1290液相色谱仪，美国安捷伦公司产品。

2 测定条件、溶液配制与血浆样品处理

色谱条件色谱柱：Shiseido CAPCELL PAK CR(1∶4)色谱柱(2.0 mm×150.0 mm, 5 μm),柱温：25 ℃;流动相：乙腈-0.1%甲酸溶液含10 mmol·L-1甲酸铵=73∶27;流速：0.3 mL·min-1;进样量：2 μL。

质谱条件Turbo V电喷雾离子源，离子源温度：550 ℃,正离子模式；多反应离子监测；喷雾电压：1 500 V;气帘气压力：172 kPa; 雾化气压力：379 kPa; 辅助气压力：365 kPa; 碰撞气：41 kPa;L-辛弗林、麻黄碱(内标)检测离子对为m/z152.0→121.1和m/z166.2→148.1,解簇电压分别为36、45 eV,碰撞能量分别为15、17 eV。

储备液及工作溶液的配制称取L-辛弗林对照品、盐酸麻碱对照品适量，分别加水溶解并制成质量浓度均为100 μg·mL-1的溶液作为L-辛弗林对照品储备液和内标储备液。吸取L-辛弗林对照品储备液和内标储备液适量，分别加水稀释成含L-辛弗林50 ng·mL-1、250 ng·mL-1、2 μg·mL-1对照品工作溶液；吸取对照品储备液适量，加水稀释成含麻黄碱250 ng·mL-1的内标工作液。

空白血浆基质溶液取空白SD大鼠血浆适量，加4倍量的甲醇涡旋2 min, 以1.3×104r·min-1离心2 min, 取上清液，于45 ℃氮吹至干，加与大鼠血浆等体积的流动相使溶解，即得空白血浆基质溶液。

血浆样品预处理吸取血浆100 μL,置1 mL离心管中，加标工作液0.1 mL内，再加甲醇0.3 mL,涡旋2 min使混合均匀，以1.3×104r·min-1离心2 min, 取上清液，于45 ℃氮吹至干，加流动相100 μL使溶解，转移至安捷伦进样衬管中，进样分析。

3 方法学考察

专属性通过测定含L-辛弗林及内标的空白基质对照品溶液，给药1 h后血浆供试品溶液，以及空白基质溶液，以考察待测物及内标色谱峰是否分离良好，内源性干扰物或样品中的其他物质是否会干扰待测组分测定。

标准曲线与定量下限分别吸取对照品储备液及内标储备液适量，加入空白血浆基质溶液稀释成分别含2、5、25、50、100、250、500、800 ng·mL-1L-辛弗林，50 ng·mL-1内标的标准曲线溶液，进样，分析测定。以L-辛弗林与内标的峰面积比值为纵坐标，以L-辛弗林浓度为横坐标，用1/x权重绘制标准曲线。以信噪比(signal to noise ratio,S/N)≥10时，L-辛弗林的浓度作为定量下限。

精密度与提取回收率用定量下限和低、中、高质量浓度(2、5、400、600 ng·mL-1)质控样品，各6份，验证方法的准确度。日内连续进样6次，考察日内精密度；连续3 d测定，考察日间精密度。取空白血浆100 μL 6份，分别加入适量L-辛弗林对照品溶液，加内标工作液0.1 mL,按“血浆样品预处理”项方法制成理论质量浓度为5、400、600 ng·mL-1的样品，测定；计算样品中L-辛弗林在血浆样品中含量，根据公式(测得值/理论值)×100%计算提取回收率。

基质效应分别空白血浆基质溶液和水配制含5、400、600 ng·mL-1L-辛弗林的基质样品和流动相溶液，进样测定；根据公式(基质溶液中L-辛弗林峰面积/流动相溶液中L-辛弗林峰面积)×100%计算基质效应。

残留效应液质联用仪在分析测定最高浓度线性样品(800 ng·mL-1)后，立即吸取血浆空白基质溶液进样，分析测定空白基质色谱图中L-辛弗林与内标色谱峰峰面积占定量下限中两者峰面积的百分比，用于考察残留效应。

稀释可靠性配制6份样品，用空白血浆基质溶液稀释5倍，测定，计算结果精密度及准确度，用于分析方法稀释可靠性。

稳定性分别取低、中、高质量浓度质控样品各6份，置室温放置24 h, -70 ℃放置30 d, 反复-70 ℃至20 ℃融冻3次，所有样品测定时均用新配制的标准曲线，计算样品中的L-辛弗林的含量相对标准偏差(relative standard deviation, RSD),用以考察样品稳定性。

4 统计学处理

用Analyst 1.6.3软件计算样品含量；用DAS 3.0软件绘制药时曲线，并计算主要药代动力学参数；用WPS Office(版本号12.1.0.15990)计算平均值、标准差、相对平均偏差、相对偏差等数据。

二、结果

1 方法学评价

专属性在基质对照品溶液、供试品溶液、空白溶液色谱中，L-辛弗林、内标(麻黄碱)保留时间分别为7.0和6.7 min。结果表明，待测物均分离良好，大鼠血浆中的内源性物质不影响L-辛弗林和内标的测定，见图 1。

标准曲线与定量下限L-辛弗林在2～800 ng·mL-1呈现良好的线性关系，线性方程为y=1.35×10-2x+2.71×10-1(R=0.997 1)。当L-辛弗林质量浓度为2 ng·mL-1时，L-辛弗林色谱峰信噪比为10,定量下限为2 ng·mL-1。

图1L-辛弗林(Ⅰ)和内标(IS;Ⅱ)化合物多反应监测色谱图

表1用超高效液相串联三重四极杆质谱法L-辛弗林的准确度、精密度与提取回收率结果

精密度与提取回收率高、中、低质量浓度质控样品日内精密度范围为和日间精密度分别为0.40%～6.21%和1.28%～5.83%,准确度分别为-1.12%～8.20%和-2.36%～6.47%。高、中、低质量浓度提取回收率平均值分别为86.87%、91.34%和94.65%。结果见表1。

基质效应测得低、中、高3个质量浓度的L-辛弗林在空白血浆中的基质效应分别为(97.34±2.08)%、(98.17±2.96)%、(101.71±3.68)%,这说明用本方法测定大鼠血浆样品中的L-辛弗林不受血浆中基质干扰。

残留效应测定进样上限的样品后，进空白基质溶液，检出L-辛弗林和内标残留峰面积与最低定量下限样品中相应的峰面积的比例分别为1.02%和0.23%,结果符合要求。

稀释可靠性测定6份稀释后样品，计算样品之间精密度以及与理论值之间的准确度，结果精密度RSD为3.45%,准确度(relative error, RE)为2.44%,稀释可靠性符合的要求。

稳定性样品置室温放置24 hL-辛弗林的RSD为2.4%、1.3%、2.1%,-20 ℃放置30 d的RSD为4.7%、3.7%、2.3%,反复-20 ℃至20 ℃融冻3次的RSD为5.4%、4.5%、5.4%,上述样品RSD均符合稳定性考察要求，满足测定需要。

2 方法学应用

6只SD大鼠给药前12 h禁食、不禁水，分别按5 mg·kg-1L-辛弗林的剂量灌胃后5、20 min和0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 h, 通过眼眶静脉丛取血采集血液0.3 mL,置肝素钠采血管中，摇匀，静置约2 min后，以2 500 r·min-1离心2 min, 取上清液，冻存待测。L-辛弗林的血药浓度-时间曲线见图2,主要药代动力学参数见表2。

图2大鼠单剂量灌胃给药L-辛弗林的平均血药浓度-时间曲线图(n=6)

表25 mg·kg-1L-辛弗林大鼠灌胃给药后的主要药代动力学参数

三、讨论

本方法用了超高效液相色谱结合Shiseido CAPCELL PAK CR(1∶4)色谱柱对待测成分进行分离，色谱柱采用了C18与强酸性阳离子交换树脂混合填料，使得小分子生物碱在色谱柱上得到良好的保留与分离，分离效果优于普通的C18色谱柱。

通过考察色谱行为与质谱的离子响应，比较了麻黄碱、槟榔碱、水苏碱等水溶性生物碱内标化合物的优劣程度。因为麻黄碱结构与L-辛弗林相似，结果麻黄碱离子响应和L-辛弗林相当，保留时间也符合要求。因此选择盐酸麻黄作为内标化合物。

枳实或同属植物果实中生物碱L-辛弗林表现出良好的降脂作用，含有该成分的天然提取物在世界各地迅速取代麻黄碱成为一种“无麻黄”的降脂减肥膳食补充剂[10-11]。本研究建立的超高效液相色谱-串联质谱法测定方法得益于三重串联四极杆质谱的高灵敏度和选择性，使得本方法的专属性良好，大鼠血浆基质未对分析物产生干扰，检测灵敏度满足药代动力学测定的要求，方法学验证总体符合要求，可以运用于血浆中L-辛弗林的测定。

基金资助:江西省重点研发计划基金资助项目(20212BBG73025); 江西省药品监督管理局科研基金资助项目(2021KY44);

文章来源:陈伟康,刘德鸿,郑洋滨,等.用UHPLC-MS/MS法测定大鼠血浆中L-辛弗林的浓度[J].中国临床药理学杂志,2024,40(15):2256-2260.