脑被认为是人体中唯一缺乏经典解剖学定义的淋巴组织的器官，淋巴管被认为在脑不存在，其主要原因是缺乏传统的血管周围通道和相关的淋巴结[1]。尽管如此，脑仍发展出了独特的适应能力，简单来说，虽然一般认为脑脊液(cerebrospinal fluid, CSF)在脉络丛中产生，但是一部分CSF仍然可通过血浆穿过血管而生成[2],脑脊液从动脉的血管周围间隙(perivascular space, PVS)流出后，在脑实质内与间质液(interstitial fluid, ISF)混合，最后通过静脉的PVS从实质中流出，汇入静脉系统，以实现诸如液体平衡和间质废物清除等功能[3]。由于上述过程与星形胶质细胞密切联系，以及与周围淋巴系统功能相似，其被命名为“脑类淋巴系统(glymphatic)”[4]。在侧脑室体部层面，PVS与髓静脉共同垂直于脑室壁，投射纤维、联络纤维与PVS走行方向呈垂直关系，几乎可以排除沿主要脑白质纤维方向扩散的水分子的影响，从而独立分析沿PVS方向扩散的水分子，这种方法被称为沿血管周围间隙弥散张量成像分析(diffusion tensor image analysis along the perivascular space, DTI-ALPS)。之前的研究发现，DTI-ALPS指数与淀粉样蛋白β(amyloid-β,Aβ)、tau蛋白和α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)的异常形成和积聚关系密切，同时，也是评价包括轻度认知功能障碍、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)、帕金森病(Parkinson’s disease, PD)、癫痫、脑小血管病(cerebral small vessel disease, CSVD)和脑卒中在内的多种神经系统疾病的生物标志物[5,6]。我们注意到，在与衰老过程相关的DTI-ALPS研究中，过去的研究发现了DTI-ALPS指数在评估老年人的大脑储备和认知储备中的价值[7],但却忽视了DTI-ALPS指数与体现创造新颖反映能力的思维灵活性之间的关系。因此，我们依托内森·克莱恩研究所罗克兰数据集(NKI Rockland Sample data set)基于DTI-ALPS技术评估脑类淋巴系统的功能，观察DTI-ALPS指数在衰老过程中的改变，并寻找DTI-ALPS指数与某些可体现思维灵活性能力的执行功能的相关性，以期望为理解衰老的生理过程以及与衰老相关的神经解剖学基础提供新的观点。

1、资料和方法

1.研究对象

我们使用内森·克莱恩研究所罗克兰数据集(NKI Rockland Sample data set, http: //fcon_1000.projects.nitrc.org/indi/pro/nki.html#LastRelease)进行研究，该数据集是共包含207名志愿者的社区代表性样本数据集，内含多模态磁共振成像序列、精神病学、认知和行为学评估数据，我们使用其中的弥散张量成像(diffusion tensor image, DTI)数据进行影像学方面的研究。在排除<18周岁的志愿者后，有2名志愿者缺少弥散张量成像(diffusion tensor image, DTI)数据，2名志愿者在数据处理阶段报错，因此，最终此数据集中有159名志愿者纳入了本研究，其中男性97例，女性62例，年龄18～85岁，平均(41.57±18.11)岁。我们依据志愿者年龄，人为地将上述数据集样本分为8个组，分别为18～19岁、20～29岁、30～39岁、40～49岁、50～59岁、60～69岁、70～79和80～85岁，各组性别构成见表1,各组间性别构成比差异无统计学意义(P>0.05)。

2.成像设备及参数

内森·克莱恩研究所罗克兰数据集使用3.0 T西门子Trio磁共振扫描仪采集的DTI影像学资料，扫描参数如下：重复时间(repetition time, TR)=10 000 ms,回波时间(echo time, TE)=91 ms,层厚=2.0 mm,视野(field of view, FOV)=256 mm×256 mm,扩散编码梯度=64,b1=0 s/mm2,b2=0、1000 s/mm2。

3.影像学资料处理

使用FSL(FMRIB Software Library, https: //fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/)工具包对DTI数据进行处理，具体步骤如下：(1)涡流校正，使用eddy_correct命令进行涡流校正，以纠正涡流引起的图像扭曲；(2)头动校正，使用mcflirt命令，使时间序列上所有的图像向第1个时刻点的b0图像对齐，以纠正采集过程中志愿者不自主的头部运动；(3)提取b0像、剥脑和制作全脑掩模图：使用fslroi命令提取时间序列上第1个b0像，再使用bet命令剥除颅骨和颅骨外软组织，以制作全脑掩模图，有利于后续计算；(4)张量拟合：使用dtifit命令生成分数各向异性(fraction anisotropy, FA)图；使用fslroi命令生成X、Y、Z轴方向上的的表观弥散率图(apparent difusion coefcient images, ADC images),同时，使用flirt命令将每个志愿者的FA图配准到FSL工具包内置的JHU-ICBM-FA模板，并将变换矩阵应用到上述X、Y、Z轴的ADC图中。

表1各年龄段分组性别构成

图1 JHU-ICBM-FA模板内ROI以及ROI区域投射纤维、联合纤维、髓静脉和血管周围间隙相对位置关系

从左至右，不同ROI颜色对应JHU-ICBM-DTI-81白质标记图谱所在白质纤维名称：蓝色．L＿SLF；红色．L＿SCR；绿色．R＿SCR；粉色．R＿SLF;L．左侧；R．右侧

图2提取水分子在X、Y、Z轴方向ROI内弥散率的均值，以计算DTI-ALPS指数

从左至右，不同ROI颜色对应JHU-ICBM-DTI-81白质标记图谱所在白质纤维名称：蓝色．L＿SLF；红色．L＿SCR；绿色．R＿SCR；粉色．R＿SLF;L．左侧；R．右侧

4. DTI-ALPS指数计算

我们在JHU-ICBM-FA模板内基于JHU-ICBM-DTI-81白质标记图谱，于侧脑室体部水平左右双侧以上放射冠(superior corona radiata, SCR)为代表的投射纤维(projection fibers)和以上纵束(superior longitudinal fasciculus, SLF)为代表的联合纤维(association fibers)位置各放置一个半径为3 mm的球形感兴趣区域(region of interest, ROI),如图1。

分别提取影像学资料处理步骤(4)中X、Y、Z轴方向上的的表观弥散率图ROI内水分子弥散率的均值，最后代入公式计算DTI-ALPS指数[5],如图2。我们依据志愿者惯用手，认为惯用手的对侧为优势半球，提取优势半球侧DTI-ALPS指数(“ambidextrous”者记为右利手，另有1名志愿者惯用手数据缺失而被记为右利手)。

5. D-KEFS设计流畅性测试

D-KEFS执行功能系统(Delis-Kaplan executive function system)是对8～89岁儿童、青少年和成人的执行功能的标准化评估工具，设计流畅性测试(design fluency test)是其9个独立测试的一部分[8,9],而设计流畅性实际准确度(design fluency practical accuracy)是设计流畅性测试的子评分项目之一[10]。设计流畅性测试简要过程如下：测试由3个子测试条件组成，分别为基本、过滤、和切换测试，每个测试条件时间均为60 s,被试者设计时只能使用4条直线来连接点，并且每条线必须在1个点处至少与另1条线相接触。在基本测试条件下，参与者被要求使用在5个实心点之间用4条直线绘制尽可能多的不同正确设计；在过滤测试条件下，同时存在5个实心点和5个空心点，参与者被要求仅在5个空心点之间用4条直线绘制尽可能多的不同正确设计；在切换测试条件下，同时存在5个实心点和5个空心点，参与者需要使用4条直线在实心点和空心点之间切换来绘制尽可能多的不同正确设计[11],按照标准化评分程序，测试结束之后，统计设计和正确设计的总数，计算设计流畅性实际准确度。

6.统计学分析

计量资料采用均值±标准差

表示，计数资料采用频数表示。使用SPSS 26.0统计学软件，采用Pearson分析相关性；对于计量资料，采用Shapiro-Wilk法进行正态性检验，采用莱文方差齐性检验检验方差齐性，使用方差分析分析各组间差异，采用Fisher LSD法进行事后比较；对于计数资料，采用似然比卡方分析组间差异；采用逐步检验回归系数法分析中介效应。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结 果

1.年龄与DTI-ALPS指数的相关性分析和DTI-ALPS指数在不同年龄段上的差异

DTI-ALPS指数在衰老过程中呈下降趋势，年龄与DTI-ALPS指数成负相关(r=-0.288,P<0.001),如图3。同时，我们分析了不同年龄段分组中受试者的DTI-ALPS指数差异，DTI-ALPS指数在各年龄段平均数的连线验证了相关分析中DTI-ALPS指数在衰老过程中总体下降趋势，但是我们发现，在60～69岁年龄段分组中存在回升的局部高峰(P<0.01),如图4。

图3 DTI-ALPS指数与年龄的相关性分析

图4 DTI-ALPS指数在不同年龄段上的分布

2.年龄和DTI-ALPS指数分别与设计流畅性实际准确度的相关性分析

我们发现，有3名志愿者缺少设计流畅性实际准确度数据，因此，共有156名志愿者纳入了以下的分析。结果显示，年龄与设计流畅性实际准确度成负相关(r=-0.298,P<0.001),如图5;DTI-ALPS指数与设计流畅性实际准确度成正相关(r=0.258,P=0.001),如图6。

图5年龄与设计流畅性实际准确度的相关性分析

图6设计流畅性实际准确度与DTI-ALPS指数的相关性分析

图7 DTI-ALPS指数在年龄和设计流畅性实际准确度之间的简单中介效应模型

3. DTI-ALPS指数在年龄与设计流畅性实际准确度之间中介效应分析

对于DTI-ALPS指数在年龄与设计流畅性实际准确度之间的作用，我们假设年龄是一个暴露变量，DTI-ALPS指数是一个潜在的中介变量，设计流畅性实际准确度是一个结果变量，由此我们建立了DTI-ALPS指数在年龄和设计流畅性实际准确度之间的简单中介效应模型，如图7,具体分析步骤如下：(1)共线性诊断：将设计流畅性实际准确度作为因变量，以年龄和DTI-ALPS指数作为自变量纳入多重线性回归模型，计算得自变量方差膨胀因子(variance inflation factor, VIF)均<10,认为自变量间不存在多重共线性；(2)检验回归系数c,即年龄对设计流畅性实际准确度的总效应，计算得β=-0.298,95%CI:-0.299～-0.097,P<0.001,因此，按中介效应立论(β为标准化系数，以下同);(3)依次检验中介效应涉及的两个路径回归系数a和b:回归系数a是年龄对DTI-ALPS指数的直接效应，计算得β=-0.288,95%CI:-0.005～-0.001,P<0.001;回归系数b是控制了年龄的影响后，DTI-ALPS指数对设计流畅性实际准确度的直接效应，计算得β=0.188,95%CI:2.008～22.075,P=0.019。可见DTI-ALPS指数对年龄和设计流畅性实际准确度的中介效应有统计学意义；(4)检验回归系数c’,即控制了DTI-ALPS指数的影响后年龄对设计流畅性实际准确度的直接效应，计算得β=-0.245,95%CI:-0.266～-0.059,P=0.002,可见DTI-ALPS指数对设计流畅性实际准确度的直接效应有统计学意义；(5)比较ab和c’的符号，可得ab和c’同号，可见DTI-ALPS指数对年龄和设计流畅性实际准确度的影响属于部分中介效应；(6)由此可见，DTI-ALPS指数对年龄和设计流畅性实际准确度影响的中介作用有统计学意义，中介效应占总效应的比例为ab/c,即22.1%。然而，年龄对设计流畅性实际准确度的中介效应不能完全通过中介变量“DTI-ALPS指数”达到影响，年龄对设计流畅性实际准确度有部分的直接效应。

3、讨 论

本研究发现，DTI-ALPS指数与年龄的相关系数为-0.288,衰老过程中DTI-ALPS指数呈降低趋势，但在60～59岁年龄段中存在局部的回升高峰。年龄与设计流畅性实际准确度的相关系数为-0.298,DTI-ALPS指数与设计流畅性实际准确度的相关系数为0.258,且DTI-ALPS指数在年龄与设计流畅性实际准确度之间存在部分中介效应。在我们的研究中，DTI-ALPS指数与年龄的线性负相关关系获得了与Taoka[12]和Hsiao[13]等研究类似的结果，同时我们注意到60～69岁年龄段DTI-ALPS指数的局部回升与Taoka等[12]的研究结果类似，但是我们的研究中没有发现40～49岁年龄段或30岁左右的DTI-ALPS指数的高峰。

蛛网膜下腔的硬膜动脉在潜入脑实质后成为穿透动脉，在动脉搏动、呼吸、缓慢血管运动和脑脊液压力梯度的共同作用下，经血管超滤形成CSF从蛛网膜下腔进入穿透动脉周围的血管周围间隙(Virchow-Robin间隙),当穿透动脉分支成小动脉和毛细血管时，含有脑脊液的Virchow-Robin间隙变窄并最终消失，来自Virchow-Robin间隙的脑脊液继续流入小动脉、毛细血管周围的PVS,表达水通道蛋白4(aquaporin 4, AQP4)的星形胶质细胞末端终足围绕整个血管系统，形成血管周围间隙的边界，在AQP4水通道的促进作用下，脑脊液进入脑实质，与ISF混合、交换的同时，推动ISF流向大深静脉周围的PVS,ISF在静脉周围空间被收集继而排出大脑，汇入静脉循环系统以实现包括液体平衡、清除代谢废物等功能[14,15]。

星形胶质细胞和血管系统的改变都可以调节PVS,正常的PVS单位由星形胶质细胞血管末端终足、血管平滑肌细胞和血管内皮细胞组成，CSF便在以上结构构成的间隙中流动。血管收缩、血管扩张或星形胶质细胞末端终足肿胀引起的PVS几何形状的剧烈变化有可能影响CSF的运动。高龄是卒中和高血压的危险因素，在急性卒中模型中，缺血性弥散性去极化使血管收缩，PVS变宽，流量增加，使CSF快速流入脑实质；高血压会增加动脉壁的硬度，导致搏动性减弱，可导致PVS液体流量多达50%的减少。随着年龄的增加，脑血管系统的曲折程度也随着年龄的增长而增加，这可能阻碍了PVS间液体的流动；在反应性胶质增生的过程中，AQP4朝着血管的星形胶质细胞末端终足的极化表达减少并发生错位，即AQP4不再局限于星形胶质细胞的末端终足，而是同时存在于星形胶质细胞的实质突起；在脑小血管病中，动脉硬化和脑动脉重塑导致PVS增大[16]。此外，老年人较低的心率和较大的血管硬度会导致动脉搏动性降低，可能影响淋巴液的清除[17]。

放射性示踪剂可以较直观地观测脑类淋巴系统的功能。1项对年轻、中年和老年小鼠进行放射性示踪剂清除测定的实验表明，年龄的增长与蛛网膜下腔脑脊液和脑实质之间交换效率的急剧下降有关[18];在对人类受试者进行的鞘内注射钆造影剂(gadolinium based contrast agents, GBCA)研究中，研究者发现，脑类淋巴通路的清除与衰老相关[19]。在以往关于DTI-ALPS指数相关的研究中，研究者发现，DTI-ALPS指数和多种与衰老、衰老相关疾病及疾病的临床表现相关。例如，ALPS指数与AD患者简易智力状态检查量表(mini mental state examination, MMSE)评定的认知功能之间成正相关，提示ALPS指数虽然反映的是局部水动力学指数，但可综合评估整个大脑的认知功能；在PD患者中，ALPS指数改变与PD患者认知能力下降，疾病阶段的系统性氧化应激以及冻结步态症状有关；在CSVD患者中，ALPS指数不仅与认知功能相关，而且与包括白质高信号、腔隙灶和脑微出血在内的CSVD影像标志物均与ALPS指数独立相关；此外，有研究发现，在2型糖尿病、慢性肾病和颈动脉粥样硬化患者中均发现ALPS指数的显著降低，提示类淋巴系统功能障碍[5]。

设计流畅性测试可以检查创造新颖反应的能力，以及思维的灵活性，旨在评估无法命名的视觉创造力(与设计流畅性相对，语言流畅性测试需要产生单词的能力，但考虑到它们存储在个人现有的词汇或语言知识中，产生的单词并不新颖，所以语言流畅性测试评估的是词汇和语义记忆的提取过程，而不是思维的产生)[20],这种创造力是由额叶，特别是前额叶皮层培养的[21,22]。例如，在1项功能磁共振研究中，AD患者标准化低频振幅(amplitude of low frequency fluctuation, ALFF)值、标准化比率低频振幅(fraction ALFF, fALFF)值和标准化波动幅度百分比(fraction ALFF, PerAF)值增高的区域均集中于前额叶皮层，提示前额叶的病变[23]。有研究发现，左侧和右侧额叶损伤患者的设计准确度较健康对照组的均较低[24]。Chi等[25]的研究发现，设计流畅性测试是检测病理性认知老化的一个简单而敏感的神经心理学标记物[25]。本研究中设计流畅性实际准确度与年龄的负相关关系说明高龄志愿者更容易违背规则而产生错误设计，这可能与衰老过程产生新颖思维能力和思维的灵活性的减弱有关。

必须指出的是，首先本研究中DTI-ALPS指数、年龄和设计流畅性实际准确度之间的相关性并不意味着其中的因果关系。其次，由于ALPS指数是根据弥散张量图像计算的，因此，需要考虑年龄对白质纤维状态可能产生的影响。本研究中呈现的数据只是DTI-ALPS指数与年龄的关系，DTI-ALPS指数可用于评估脑类淋巴系统功能，但并不能保证脑类淋巴系统与年龄的关系。最后，DTI-ALPS指数在年龄与设计流畅性实际准确度之间中介效应只是基于统计结果分析的适度推论，真正的因果关系或者内部机制还需要实验性研究逐步明确。

综上所述，我们依托内森·克莱恩研究所罗克兰数据集观察了DTI-ALPS指数在衰老过程中的改变，以及DTI-ALPS指数与某些特定的体现思维灵活性能力的执行功能的相关性，这为理解衰老的生理过程以及与衰老相关的神经解剖学基础提供了新的观点。

基金资助:国家自然科学基金(81874389);

文章来源:黄辰烨,李祥君,谢道俊.衰老过程中沿血管周围间隙弥散张量成像分析指数的改变[J].解剖学报,2024,55(04):501-507.