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miR-199a调控Sirt1对SH-SY5Y细胞氧化损伤的影响

2025-01-18 60 上传者：管理员

摘要：目的探讨miR-199a调控Sirt1对人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）氧化损伤的影响。方法采用H2O2（1 200μmol/L）分别刺激体外培养的SH-SY5Y细胞3、6、9、12、15 h, MTT法检测细胞活力，DCFA-DA探针法检测细胞内ROS水平；miR-199a模拟子和抑制物分别转染SH-SY5Y细胞48 h, Western blot检测Sirt1蛋白的表达；miR-199a模拟子和抑制物分别转染SH-SY5Y细胞48 h后采用H2O2（1 200μmol/L）刺激12 h,生化法检测细胞超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量。结果不同时间H2O2刺激SH-SY5Y细胞时细胞活力，细胞内超氧化物歧化酶含量升高，且呈现时间依赖性；miR-199a模拟子可抑制SH-SY5Y细胞Sirt1蛋白表达，miR-199a抑制物增加SH-SY5Y细胞Sirt1蛋白表达；当SH-SY5Y细胞处于氧化损伤时，miR-199a模拟子可降低细胞超氧化物歧化酶活性和升高丙二醛含量，miR-199a抑制物增加细胞活力、降低细胞内超氧化物歧化酶含量、升高超氧化物歧化酶活性和降低丙二醛含量。结论当SH-SY5Y细胞处于氧化损伤状态时，miR-199a调控Sirt1进一步加重SH-SY5Y细胞氧化损伤。

关键词：
miR-199a
SIRT1
人神经母细胞瘤细胞
氧化损伤
神经退行性疾病
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随着人口老龄化，神经退行性疾病的发病率逐年上升，此类疾病严重影响老年人的生活质量并给社会造成重大的经济负担。研究[1]发现，氧化损伤导致的神经细胞凋亡是神经退行性疾病发生的重要病理基础。因此，如何减轻氧化损伤导致的神经细胞凋亡对防治神经退行性疾病具有重要的科学意义。MicroRNA(miRNA)是一类内源性的非编码的小分子单链RNA,通过与靶mRNA的3’端非编码区(3’UTR)完全或不完全互补配对，使其降解或翻译受抑制，发挥转录后水平调控基因表达的作用[2]。miR-199a在脑组织神经元中含量丰富，与神经元损伤存在密切的联系[3]。F.Li等[4]的研究表明，miR-199a在脑缺血/再灌注损伤体内调节神经元生存发挥了重要作用。J.Song等[5]的研究表明牛蒡子苷元可通过调控miR-199a减轻SH-SY5Y神经元的机械损伤。课题组前期研究[6]表明，当SH-SY5Y细胞处于氧化应激损伤状态时，miR-199a表达量增加且与氧化应激程度成正比，而Sirt1蛋白含量随氧化应激程度增加而减少。当SH-SY5Y细胞处于氧化应激损伤状态时，miR-199a调控Sirt1对SH-SY5Y细胞氧化应激损伤的影响的研究从未见报道。因此，本文以SH-SY5Y细胞为研究对象，用不同时间H2O2刺激SH-SY5Y细胞建立神经细胞氧化应激损伤模型，观察miR-199a调控Sirt1对SH-SY5Y细胞氧化应激损伤的影响。

1、材料与方法

1.1实验材料

人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)由华中科技大学同济医学院惠赠。H2O2分析纯由北京化工厂生产；胎牛血清购于杭州天杭生物科技有限公司；DMEM培养基，Gibico公司；四甲基偶氮唑盐(Tetramethylazo salt, MTT)购于武汉博士德生物科技有限公司；活性氧检测试剂盒购于碧云天生物技术研究所；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)试剂盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)试剂盒购于上海雅吉生物科技有限公司；miR-199a模拟子和抑制物购于Ambion公司；Dharmafetc TM siRNA转染试剂，Thermo Fisher Scienctific公司；内参β-actin购于Santa Cruz公司；兔源、抗Sirt1单克隆抗体购于Millipore公司；化学发光剂ECL购于碧云天生物技术研究所。

1.2实验仪器

NU-4750E型二氧化碳培养箱购于美国NuAire公司；SW-4T-2F洁净工作台购于上海江莱生物科技有限公司；KQ-500B超声波清洗器购于郑州宝晶电子科技有限公司；NIKON TP1020荧光倒置显微镜购于日本Olympus公司；DMR型多功能显微镜及图像分析系统购于英国Syngne公司。

1.3实验方法

1.3.1 SH-SY5Y细胞培养

SH-SY5Y细胞用含10%血清的DMEM培养基，37℃5% CO2培养箱培养。

1.3.2 MTT法检测SH-SY5Y细胞活力

取对数生长期的SH-SY5Y细胞接种于96孔板，H2O2(1 200μmol/L)连续刺激3、6、9、12、15 h后加入20μL MTT(5g/L)继续孵育4 h,弃上清液，每孔加入150μL DMSO进行溶解，酶联免疫检测仪检测各孔的吸光值。

1.3.3 DCFH-DA探针法检测SH-SY5Y细胞内ROS水平

取对数生长期的SH-SY5Y细胞接种在6孔板中，H2O2刺激3、6、9、12、15 h后按照细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)检测试剂盒说明书处理细胞，在荧光显微镜下观察并拍照。

1.3.4 miRNA转染

取对数生长期的SH-SY5Y细胞接种于6孔板中，根据Dharmafetc TM siRNA转染试剂说明书将100 nmol/L miRNA-199a模拟子和抑制物分别转染SH-SY5Y细胞48 h。

1.3.5 Western blot检测SH-SY5Y细胞中Sirt1的表达

实验各组细胞培养终止后将定量的蛋白样品于95℃变性5～10 min后分别进行电泳和转膜，一抗孵育4℃过夜，二抗室温孵育1 h,增强化学发光剂显影，胶片曝光，定影。

1.3.6生化法检测SH-SY5Y细胞SOD活性和MDA含量

实验各组细胞培养终止后根据上海雅吉生物科技有限公司试剂盒说明书对SOD活性和MDA含量进行检测。

1.4统计学方法

采用SPSS18.0软件对数据进行分析，Western blot数据采用Image J软件分析，数据用柱状图表示，组与组之间采用单因素方差进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1不同时间点H2O2刺激SH-SY5Y神经细胞对细胞活力的影响

H2O2(1 200μmol/L)分别刺激体外培养的SH-SY5Y细胞3、6、9、12、15 h后，细胞活力下降，且具有时间依赖性。见图1。

图1不同时间点H2O2刺激SH-SY5Y细胞对细胞活力的影响

2.2不同时间点H2O2刺激SH-SY5Y细胞对细胞内ROS含量的影响

H2O2(1 200μmol/L)分别刺激体外培养的SH-SY5Y细胞3、6、9、12、15 h后，细胞ROS含量增加，且具有时间依赖性。见图2。

图2不同时间点H2O2刺激SH-SY5Y细胞对细胞内ROS含量的影响

2.3 miR-199a模拟子和抑制剂对SH-SY5Y细胞Sirt1蛋白量表达的影响

miR-199a模拟子和抑制剂分别转染SH-SY5Y细胞48 h后，与miR-199a模拟子对照组比较，miR-199a模拟子组Sirt1蛋白量表达下降；与miR-199a抑制剂对照组比较，miR-199a抑制剂组Sirt1蛋白量表达上升。见图3。

图3miR-199a模拟子和抑制剂对SH-SY5Y细胞Sirt1蛋白量表达的影响

2.4 miR-199a模拟子和抑制剂对氧化损伤状态下SH-SY5Y细胞SOD活性和MDA含量的影响

miR-199a模拟子和抑制剂分别转染SH-SY5Y细胞48 h后采用H2O2(1 200μmol/L)刺激12 h,与模拟子对照组比较，模拟子对照+H2O2组神经细胞SOD活性下降，MDA含量增加；与模拟子对照组+H2O2组比较，模拟子组+H2O2组神经细胞SOD活性下降，MDA含量增加，并且具有显著性差异；与抑制剂对照组比较，抑制剂对照+H2O2组神经细胞SOD活性下降，MDA含量增加；与抑制剂对照组+H2O2组比较，抑制剂组+H2O2组神经细胞SOD活性增加，MDA含量减少，并且具有显著性差异。见表1。

表1miR-199a模拟子和抑制剂对氧化损伤状态下SH-SY5Y细胞细胞SOD活性和MDA含量的影响

3、讨论

H2O2是一种氧自由基，在引发神经元细胞的损伤以及死亡中起到关键的作用[7]。研究[8-9]表明，氧化损伤与神经退行性疾病发生发展存在密切的联系。研究[10]表明，miRNA可通过调控神经炎症有效对抗重度抑郁症。L.Wu等[11]的研究发现，右美托咪定通过调节miR-199a/HIF-1α保护PC12神经细胞免受氧化损伤。因此，以氧化应激损伤为切入点研究神经退行性疾病的发病机制成为热点。但目前研究神经退行性疾病的发病机制基本上都是以大分子基因为靶点，miRNA很少被提及，研究[12]发现，miRNA与氧化损伤关系密，因此，miRNA有可能会成为今后研究神经退行性疾病的新靶标以及为科研人员研究神经退行性疾病发病机制提供新思路。

miRNA通过与靶mRNA的3’非翻译区结合，从而降解靶mRNA或者抑制mRNA翻译。通过对靶mRNA的抑制，miRNA参与调控细胞的发育、生长、分化、增殖以及凋亡。研究[13]表明，miRNA调控转录分子结构失调参与了神经退行性疾病的发展。Q.Zhou等[14]的研究表明，miR-199a通过下调Sp1/LRRK2信号通路加速了帕金森病的进展。F.Xu等[15]的研究表明，通过抑制miR-199a表达可以减轻SH-SY5Y细胞损伤。

Sirt1是Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylases, HDACs),是哺乳动物SIR2家族蛋白的同系物，可以调节多种细胞的生理过程，包括代谢、炎症、增殖、衰老和凋亡等。Sirt1蛋白在神经系统中具有保护性作用，通过去乙酰化作用于靶蛋白如p53、叉头蛋白转录因子O(FoxO)、氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator-1α,PGC-1α)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)等影响凋亡因子、神经炎症、氧化应激、线粒体发生，达到对神经细胞凋亡的调控。研究表明，Sirt1是神经退行性疾病临床治疗的重要靶点[16]。W.Cui等[17]的研究发现，Sirt1蛋白可减轻脑损伤诱导的线粒体功能障碍和神经元凋亡。另外，Y.Sun等[18]的研究发现miR-199a通过抑制Sirt1蛋白介导的p21去乙酰化来加速神经髓核细胞凋亡。

本研究发现，当不同时间点H2O2刺激SH-SY5Y细胞后，随着时间的延长，SH-SY5Y细胞活力下降和ROS含量增加，具有时间依赖性。当SH-SY5Y细胞处于氧化损伤状态下，miR-199a靶向调控Sirt1蛋白进一步加重神经细胞氧化损伤，因此，降低miR-199a水平来减轻神经细胞氧化损伤程度，有可能成为神经退行性疾病治疗的新靶点。

参考文献:

[1]张丽,孟兰霞,张振涛.花生四烯酰多巴胺对H2O2诱导SH-SY5Y细胞氧化应激损伤的保护作用[J].卒中与神经疾病,2020,27(6):705-709,716.

[6]万静枝,袁丁,邓丽丽,等.SH-SY5Y神经细胞氧化损伤时microRNA-199a和Sirt1表达变化[J].生物技术,2014,24(2):72-76.

[7]陈锡俊,张慧媛,唐慧,等.人参二醇总皂苷对H2O2诱导的SH-SY5Y神经细胞氧化损伤防护作用[J].长春中医药大学学报,2020,36(3):461-464.

文章来源:万静枝,王婷,廖勇.miR-199a调控Sirt1对SH-SY5Y细胞氧化损伤的影响[J].贵州医药,2025,49(01):3-6.