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基于阿尔茨海默病小鼠模型的细叶远志皂苷对肝肾影响研究

2024-12-05 107 上传者：管理员

摘要：目的:基于阿尔茨海默病(AD)小鼠模型观察细叶远志皂苷(Tenuifolin)对小鼠一般状态及肝肾的影响。方法:40只雄性阿尔茨海默模型小鼠(APPswe/PSEN1dE9双转基因小鼠，APP/PS1小鼠)随机分为4组：模型组、细叶远志皂苷低、中、高剂量组，每组10只。另取10只同系野生型C57BL/6J小鼠作为正常对照组。各剂量组灌胃给予细叶远志皂苷低、中、高剂量(20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg),正常对照组及模型组小鼠灌胃给予同体积0.3%羧甲基纤维素钠溶液，1次/d,连续给药90 d。给药期间观察小鼠一般状态，每周测一次体质量。末次给药后处死小鼠，取肝脏及肾脏称重并计算肝脏系数及肾脏系数；HE染色观察小鼠肝肾组织病理变化。结果:与正常对照组相比，细叶远志皂苷各剂量组小鼠状态无明显异常，体质量、肝脏及肾脏系数未见显著变化(P>0.05);与正常对照组相比，细叶远志皂苷各剂量组肝肾组织无明显形态学变化。结论:细叶远志皂苷对APP/PS1小鼠基本无毒，不引起肝肾损伤，安全性较高。

关键词：
APP/PS1小鼠
智力发育
细叶远志皂苷
肝毒性
肾毒性
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远志来源于远志科植物远志Polygala tenuifoliaWilld.或卵叶远志P.sibiricaL.的干燥根，有促进智力发育的功效，是临床治疗痴呆的传统中药[1]。细叶远志皂苷(Tenuifolin)是远志总皂苷碱水解的次级皂苷成分，能通过血脑屏障，具有改善痴呆小鼠学习记忆、认知功能障碍等作用[2-3]。阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一种原发性神经退行性脑疾病，患者临床表现为认知能力及日常功能的渐进性退化，脑内出现β-淀粉样蛋白沉积形成的老年斑，以及Tau蛋白异常磷酸化在神经元内形成的纤维缠结等异常病理改变[4]。近年来，研究显示，细叶远志皂苷可通过多种途径减少β-淀粉样蛋白积累，抑制β-淀粉样蛋白引起的神经元凋亡，增强神经元的抗氧化应激能力，减轻神经元损伤，延缓阿尔茨海默病进展[5-9],有望开发成阿尔茨海默病治疗药物。

阿尔茨海默病是慢性退行性疾病，病程长，患者需长期服药。在药物研发过程中，评价药物安全性是减少用药风险的重要环节。肝肾是药物排泄的主要器官，长期用药发生毒性反应的概率高于其他脏器，肝肾毒性反应是药物毒理学研究重点关注的指标。长期使用细叶远志皂苷是否会导致肝、肾蓄积毒性未见报道。已有报道中细叶远志皂苷相关动物实验给药剂量最小为3 mg/kg[10],最大为80 mg/kg[11-12],给药时间最短为9 d[10],最长为90 d[2,11]。本研究基于细叶远志皂苷能较好改善APP/PS1小鼠AD症状的前期研究基础，着重考察细叶远志皂苷以有效剂量给药90 d是否导致蓄积性肝肾毒性，以及对APP/PS1小鼠一般状态、体质量的影响，以评估细叶远志皂苷的安全性，为后续药效机制研究及抗AD药物开发提供参考。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物

SPF级APP/PS1(APPswe/PSEN1dE9,APP/PS1)双转基因雄性小鼠40只及SPF级同系野生型C57BL/6J雄性小鼠10只，3～4月龄，动物许可证号：SCXK(苏)2015-0001,购自南京大学模式动物研究所。动物饲养于广东药科大学实验动物中心SPF级动物房，温度(24±2°)C,相对湿度55%±15%,一天中光照/黑暗时间为12/12 h。所有小鼠自由摄食饮水，两天更换垫料一次。本研究涉及的动物实验严格遵守广东药科大学《实验动物伦理委员会章程》相关规定。

1.1.2药物与主要试剂

细叶远志皂苷(货号A1023AS,纯度>98%),购于大连美仑生物技术有限公司；苏木素染料(货号AR-0712),购于北京鼎国昌盛生物有限公司；水溶性伊红染料(货号AR-0731),购于北京鼎国昌盛生物有限公司。

1.1.3主要仪器

石蜡切片机(沈阳恒松科技有限公司，型号：HS-S7120-B);组织包埋机(沈阳恒松科技有限公司，型号：HS-B426-A);摊烘烤片一体机(沈阳恒松科技有限公司，型号：HS-TK7218):制冰机(常熟市雪科电器有限公司，型号：IMS-70);光学显微镜(日本Olympus公司，型号：BX51);电子天平(上海精天电子仪器有限公司，型号：JT3101N)。

1.2方法

1.2.1小鼠分组及给药

将40只雄性APP/PS1小鼠随机分为APP/PS1模型组、细叶远志皂苷低、中、高剂量组，每组10只；另取10只同系野生型小鼠作为正常对照组。细叶远志皂苷低、中、高剂量组给药剂量分别为20 mg/kg、40 mg/kg及80 mg/kg(溶解于0.3%羧甲基纤维素钠溶液),正常对照组及模型组小鼠灌胃给予等体积0.3%羧甲基纤维素钠溶液。各组小鼠每日给药1次，连续给药90 d。

1.2.2小鼠一般体征观察及体质量测定

给药期间，观察小鼠活动情况、精神状态、毛发光泽、进食量、饮水量等行为表现，每日2次，若有动物死亡，记录死亡数及解剖观察死亡小鼠的脏器变化。首次给药前测定小鼠体质量，此后每周测定小鼠体质量1次。

1.2.3小鼠脏器系数测定

末次给药2 h后，小鼠脱颈椎处死，解剖、观察各组小鼠脏器的变化情况，取肝脏、肾脏，用生理盐水冲洗滤纸吸干水分，称重，按以下公式计算肝脏及肾脏脏器系数。脏器系数=脏器质量(mg)/小鼠体质量(g)。

1.2.4小鼠肝脏和肾脏组织病理学检查[13]

小鼠肝肾组织称重后立即放入4%多聚甲醛固定，按常规步骤脱水、包埋、切片。切片厚5μm,进行苏木精-伊红(HE)染色。在光学显微镜下观察肝、肾组织形态结构变化。

1.2.5统计学分析

应用SPSS 26.0统计学软件进行数据分析，计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1细叶远志皂苷对APP/PS1小鼠一般体征及体质量的影响

给药期间，各组小鼠活动、毛色、食欲、大小便未见明显异常，各组均无小鼠死亡。由表1可知，与正常对照组相比，APP/PS1模型组及细叶远志皂苷各剂量组小鼠体质量无显著性差异(P>0.05)。

表1细叶远志皂苷对APP/PS1小鼠体质量的影响

2.2细叶远志皂苷对小鼠肝、肾脏器系数的影响

由表2可知，与正常对照组比较，APP/PS1模型组及细叶远志皂苷各剂量组小鼠肝脏脏器系数略低，差异无统计学意义(P>0.05)。与正常对照组相比，APP/PS1模型组及细叶远志皂苷小鼠肾脏脏器系数略高，差异无统计学意义(P>0.05)。

表2细叶远志皂苷对APP/PS1小鼠肝、肾脏器系数的影响

3细叶远志皂苷对小鼠肝脏组织病理学的影响

给药结束后剖检发现，与正常对照组比较，APP/PS1模型组及细叶远志皂苷各剂量组小鼠肝脏呈正常暗红色，未见肿胀，无异常病变。肝脏病理组织学检查结果显示，正常对照组小鼠肝细胞排列整齐有序，肝索清晰，肝小叶结构完整，肝细胞质无空泡化。与正常对照组相比，APP/PS1模型组及细叶远志皂苷各剂量组小鼠肝组织未见显著变化。见图1。

图1细叶远志皂苷对APP/PS1小鼠肝脏组织病理学的影响(HE×200)

2.4细叶远志皂苷对小鼠肾脏组织病理学的影响

给药结束后剖检发现，与正常对照组比较，APP/PS1模型组及细叶远志皂苷各剂量组小鼠肾脏无异常改变。肾脏病理组织学检查结果显示，正常对照组肾小球及肾皮质、髓质未见充血，分界清晰，肾小球结构完整无明显萎缩，肾小球系膜细胞及系膜基质无明显增生，肾小管间质无炎症细胞浸润，无明显纤维化。与正常对照组比较，APP/PS1模型组及细叶远志皂苷各剂量组小鼠肾组织未见显著变化。见图2。

图2细叶远志皂苷对APP/PS1小鼠肾脏组织病理学的影响(HE×200)

3、讨论

远志具有益智安神、交通心肾的功效，但其生品具有一定毒性，临床常使用炮制品以减少不良反应。研究表明，远志中总皂苷类成分是抗痴呆的活性成分，也是刺激胃肠道的毒性成分，经过炮制，水解为低毒性效果的次级皂苷，胃肠刺激大幅降低而益智作用显著增强[14-20]。研究表明，远志皂苷碱水解的主要成分细叶远志皂苷，能通过多种机制减轻β-淀粉样蛋白沉积引起的神经元凋亡、氧化应激、炎症损伤等，显著改善小鼠的空间学习记忆能力，具有防治AD的潜力[2,11,21-22]。药物毒理学研究是药物研究中的重要环节，目前仅有细叶远志皂苷抑制细胞增殖的研究报道[23],缺乏实验动物长期给药导致蓄积肝肾毒性的相关研究。APP/PS1小鼠具有类似AD患者的病理表现，是可靠的AD疾病模型，APP/PS1小鼠是毒理学实验对象，较正常小鼠更能反映临床实践用药的潜在毒性。

本研究通过观察不同剂量的细叶远志皂苷重复给药对APP/PS1小鼠一般状态、体质量及肝肾组织病理学的影响，探讨细叶远志皂苷可能存在的长期毒性作用。结果显示，与正常对照组小鼠相比，APP/PS1模型组及细叶远志皂苷各剂量组小鼠皮毛、精神状态及活动无明显异常，实验期间未出现小鼠异常死亡，体质量差异无统计学意义(P>0.05),肝、肾脏器系数及组织病理学指标差异无统计学意(P>0.05),表明细叶远志皂苷长期给药(90 d)对APP/PS1小鼠肝肾无显著毒副作用，安全性较高，填补了细叶远志皂苷毒理学研究内容，为其后续的机制研究及抗AD药物开发提供参考。

参考文献:

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