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双氢青蒿素配伍芍药苷对Aβ介导的神经炎症的影响

2025-07-25 46 上传者：管理员

摘要：目的双氢青蒿素配伍芍药苷对β-淀粉样蛋白(Aβ)介导的神经炎症的影响。方法淀粉样前体蛋白(APP)/早老素(PS)1双转基因小鼠20只及WT小鼠5只，随机分为野生组(WT小鼠)、双转基因组(APP/PS1双转基因小鼠)、双氢组、芍药苷组、双氢+芍药苷组各5只。采用免疫组化测定APP/PS1和WT小鼠大脑皮质Aβ蛋白质含量，酶联免疫吸附试验(ELISA)测定肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-1β含量及苏木素-伊红(HE)染色观察大脑皮质神经细胞的细胞形态，水迷宫测定小鼠认知行为变化。结果双氢组、芍药苷组、双氢+芍药苷组相对于双转基因小鼠，Aβ面积明显减少(P<0.001);双氢组、芍药苷组、双氢+芍药苷组相对于双转基因小鼠，TNF-α和IL-1β含量明显减少(P<0.001);双氢组、芍药苷组、双氢+芍药苷组神经细胞排列整齐，细胞质、核着色均匀。双氢组、双氢+芍药苷组总路程和潜伏时间显著小于双转基因小鼠(P<0.001);芍药苷组相对于双转基因小鼠结果无统计学差异(P>0.05)。结论双氢青蒿素或芍药苷或双氢青蒿素配伍芍药苷可以减少APP/PS1双转基因小鼠大脑皮质内的Aβ蛋白沉积，可以改善TNF-α和IL-1β含量，可以使神经细胞排列规整，细胞质、核着色均匀。双氢青蒿素/双氢+芍药苷可以改善小鼠的认知行为。

关键词：
β-淀粉样蛋白
双氢青蒿素
炎症因子
芍药苷
阿尔茨海默病
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阿尔茨海默病(AD)是一种神经退行性疾病,随时间发展,患者会发生不可逆的认知记忆损伤｡数据表明,AD死亡率1999~2019年增加了88%,并且预计到2030年我国患者将超过2000万例〔1〕｡AD的发病假说有很多,但没有一种能完全解释其发病机制｡因此AD可能是一个多病因起源的复杂性疾病｡β⁃淀粉样蛋白(Aβ)是淀粉样前体蛋白(APP)的降解产物,经过不同的剪切方式断裂后产生的一种41~43个残基的多肽｡Aβ凝聚在脑实质内的沉积可以启动病理级联反应,导致神经细胞的突触､轴索损伤,继而神经元也会变性､凋亡〔2〕｡氧化应激是指氧自由基的产生和清除之间的平衡失调,进而损伤神经系统〔3〕｡芍药苷可提高细胞的抗氧化能力并且减少小鼠海马区和皮质中异常活化的神经胶质细胞的数量〔4〕｡在中枢神经系统中,双氢青蒿素(DHA)具有抑制神经炎症,修复神经损伤的功能〔5〕｡本文将对比DHA和芍药苷各自及二者联用对APP/早老素(PS)1转基因小鼠的作用来为AD药物的开发提供新的思路｡

1、材料与方法

1.1实验材料水迷宫(上海移数信息科技有限公司);轮转式切片机(徕卡显微系统上海有限公司RM2235);离心机(SIGMA,3⁃18KS);苏木素⁃伊红(HE)染液(北京索莱宝科技有限公司24000009);免疫组化试剂盒(ELABSCIENCEDZ03BTXP1078);酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海吉至生化科技有限公司)｡

1.2实验动物实验选取雌性APP/PS1双转基因小鼠20只及WT小鼠5只,9周龄,购自常州卡文斯实验动物有限公司〔SCXK(苏)2021⁃0013〕,正常温控,自由饮水摄食｡实验由齐齐哈尔医学院的动物护理和使用委员会批准,用于动物的实验｡

1.3实验动物处理实验分为野生组(WT小鼠)､双转基因组(APP/PS1双转基因小鼠)､双氢组､芍药苷组､双氢+芍药苷组各5只｡野生组和双转基因组:常规饲养,不进行任何处理｡双氢组:APP/PS1双转基因小鼠给予20mg/(kg·d)DHA;芍药苷组:APP/PS1双转基因小鼠给予20mg/(kg·d)芍药苷;芍药苷+双氢组:APP/PS1双转基因小鼠给予DHA+芍药苷各20mg/(kg·d)配伍｡给药各组灌胃每天1次,治疗3个月｡药物剂量的选择经半数抑制浓度(IC50)检测｡

1.4免疫组织化学染色法实验动物处死后,迅速取出脑组织,分离出大脑皮质｡经固定､脱水､透明､浸蜡和包埋处理后,将大脑皮质切成厚度4~5μm的石蜡切片｡一抗和碱性磷酸酶标记处理过的特异性二抗滴加在切片上,孵育｡用苏木素溶液进行复染,脱水,晾干｡用中性胶固定密封,显微镜观察｡给予免疫组织化学方法,对蛋白进行检测〔6,7〕｡

1.5ELISA将大脑皮质称重后,按质量体积比(如1∶9)加入预冷的磷酸盐缓冲液(PBS),冰上匀浆,制成细胞悬浮液｡4℃､12000r/min离心15min,取上清液｡加入ELISA试剂盒,检测炎症因子含量〔8〕｡

1.6HE染色取小鼠海马组织放入4%多聚甲醛溶液中固定24~48h,经梯度乙醇脱水､二甲苯透明后,石蜡包埋｡将包埋好的组织块切成厚度约5μm的切片,贴片､烤片后经二甲苯脱蜡､梯度乙醇水化后,依次浸入苏木素染液(5~10min)和伊红染液(1~2min),用盐酸酒精分化,氨水返蓝,梯度乙醇脱水,二甲苯透明｡观察细胞形态〔9〕｡

1.7水迷宫实验将小鼠从不同象限放入水中,记录小鼠的潜伏期和总路程,观察小鼠认知行为的改变｡

1.8统计学处理采用SPSS20.0软件进行t检验｡

2、结果

2.1DHA配伍芍药苷对大脑皮质Aβ蛋白的影响相较于野生组,双转基因组Aβ面积明显增多(P<0.001);相较于双转基因组,双氢组和芍药苷组Aβ面积明显减少(P<0.001);相较于双转基因组､双氢组､芍药苷组,双氢+芍药苷组Aβ面积明显减少(P<0.001)｡见图1､表1｡

2.2DHA配伍芍药苷对肿瘤坏死因子(TNF)⁃α和白细胞介素(IL)⁃1β的影响相较于野生组,双转基因组TNF⁃α､IL⁃1β水平明显增多(P<0.001);相较于双转基因组,双氢组和芍药苷TNF⁃α､IL⁃1β水平明显减少(P<0.001);相较于双转基因组､双氢组､芍药苷组,双氢+芍药苷组TNF⁃α､IL⁃1β水平明显减少(P<0.001)｡见表1｡

2.3水迷宫实验结果相较于野生组,双转基因组总路程､潜伏期明显增多(P<0.001);相较于双转基因组,双氢组总路程､潜伏期明显减少(P<0.001);芍药苷组与双转基因组以上指标差异无统计学意义(P>0.05);相较于双转基因组､芍药苷组,双氢+芍药苷组总路程及潜伏期明显减少(P<0.001)｡见表1｡

图1各组大脑皮质内Aβ沉积(免疫组化染色,×400)

表1各组大脑皮质Aβ､TNF⁃α､IL⁃1β水平及水迷宫实验总路程､潜伏期比较(x±s,n=5)

2.4DHA配伍芍药苷对海马神经细胞的影响野生组神经细胞排列规则,细胞大小形态相似,细胞质细胞核染色均匀;双转基因组神经细胞紊乱,核固缩深染;双氢组神经细胞排列较为规整,细胞核固缩深染减少;芍药苷组神经细胞散在分布排列较不规则;双氢+芍药苷组神经细胞排列规整,形态正常｡见图2｡

图2各组海马神经细胞形态(HE染色,×400)

3、讨论

AD是一种以进行性认知功能衰退和神经退行性病变为特征的复杂性疾病,其核心病理包括Aβ沉积､神经炎症和神经元丢失｡APP/PS1双转基因小鼠因能模拟人类AD患者脑内Aβ沉积和神经炎症等典型病理特征,常被用于AD药物研发的动物模型研究｡AD的发病假说多样,但多集中于Aβ异常代谢､炎症反应和氧化应激的协同作用｡APP由β⁃分泌酶､γ⁃分泌酶水解产生Aβ40和Aβ42｡Aβ42可以致病,能导致APP沉淀形成老年斑(SPs)〔10〕｡AD患者尸检的脑内有异常激活的小胶质细胞和星形胶质细胞和高表达的炎症因子如IL⁃1､IL⁃6､TNF⁃α,而正常人无此反应〔11,12〕,AD的主要发病机制包括脑内的炎症反应,Aβ蛋白沉积,氧化应激反应〔13〕｡

芍药苷是提取于芍药或牡丹(毛茛科)根皮中的物质,有水溶性〔14〕｡芍药苷在提高认知能力的方面临床证实有效,广泛应用于临床治疗AD､癫痫､神经退行性疾病等神经系统疾病和相关基础研究〔15〕｡芍药苷对正常的胆碱能神经元的保护作用的机制是改善生长因子的代谢途径和作用途径｡家族性AD模型APP/PS1转基因小鼠皮层中存在的非正常的活化的胶质细胞的数量可以在芍药苷的作用下有效减少〔16,17〕｡因此芍药苷可对AD细胞模型的抗氧化能力有影响｡AD早期会引发线粒体的功能障碍,导致线粒体的氧代谢减少,钙离子不平衡,氧化增加和细胞的凋亡机制｡芍药苷对多种AD动物和细胞模型有干预效果,在降低细胞凋亡､炎症反应和氧化应激等方面发挥不可替代的作用,在AD的治疗中发挥作用｡DHA分子式为C12H24O5,是草本植物黄花蒿中的成分青蒿素的衍生物,由青蒿素经四氢硼钠还原而成〔18〕｡研究发现,DHA具有抗炎､抗肿瘤的作用,可通过调节炎症反应过程中免疫应答､多种细胞因子等信号通路和相关蛋白表达的方式来抑制炎症的发生〔19〕｡有研究证明,脂多糖(LPS)刺激可诱导神经胶质细胞活化引起神经系统炎症｡DHA通过抑制了LPS诱导的BV⁃2细胞活化,减少IL⁃6表达｡LPS炎症信号向胞内传导主要依靠TLR4受体,在AD的发生､发展中起着重要的作用〔20〕｡NF⁃κB是LPS所介导TLR4通路中的下游通路,DHA通过抑制TLR4的表达,并抑制LPS所致的NF⁃κBp65向核内转位,从而减少了NF⁃κB游离入核,最终减少了炎性因子的转录和表达,由此发挥抗炎作用〔21〕｡

在中枢神经系统中,TNF⁃α在小胶质细胞的激活中起到重要的调控作用,参与全身的炎症反应,当胶质细胞受到炎症刺激后,可释放TNF⁃α〔22〕｡神经病理性疼痛(NP)参与到胶质细胞过度激活,通过构建了海马连续注射TNF⁃α导致的NP模型,DHA可改变小鼠海马CA1和CA3锥体神经元树突,其分支数和总长度会增多,且呈现剂量依赖性改善,DHA可以有效抑制中枢小胶质细胞激活和TNF⁃α表达〔23〕｡小胶质细胞的激活导致神经炎症是AD发生的重要因素及始动环节,通过抑制小胶质细胞的激活或者阻止细胞毒性代谢产物的释放对预防AD及延缓疾病的进程有重要意义｡

APP/PS1小鼠是一种过量产生Aβ1~42蛋白且同时造成蛋白沉积的转基因小鼠模型｡在饲养6~15个月后,会出现斑块沉淀､胶质增生､神经丢失､突触丢失､长时程增强/长时程抑制(LTP/LTD)改变等病理性改变和认知损伤改变｡这种小鼠常用于研究的AD神经病理机制和药物对AD的治疗作用〔24,25〕｡这种小鼠是通过脘病毒蛋白启动子驱动下的表达突变的APP和PS1的结合形成的｡APP在分泌酶的作用下切割形成多肽,这部分多肽是构成AD小鼠的大脑的淀粉样斑块的蛋白质重要组成成分｡PS通过对γ⁃分泌酶的调控,进而控制淀粉样前蛋白的切割〔26,27〕｡

本文结果表明,DHA配伍芍药苷可以减少APP/PS1双转基因小鼠大脑皮质内的Aβ蛋白的沉积,可以改善TNF⁃α和IL⁃1β含量,可以使神经细胞排列规则,数量增多,细胞质和细胞核着色均匀,细胞饱满,轮廓清晰,故在AD治疗中发挥重要作用,在今后研究治疗AD的药物具有重要意义｡

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