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Ghrelin 基因单核苷酸多态性与老年痴呆及认知功能相关性

2024-02-19 42 上传者：管理员

摘要：目的探讨饥饿素(Ghrelin)基因单核苷酸多态性与老年痴呆及认知功能的相关性。方法选择老年痴呆患者100例；另选择健康体检老年人72例为对照组。采用荧光定量多聚合酶链反应检测Ghrelin基因多态性。采用简易精神状态检查(MMSE)量表和阿尔茨海默病评定量表-认知(ADAS-Cog)量表评定患者认知功能；采用痴呆患者生活质量量表(QOL-AD)和日常生活活动能力(ADL)评价患者生活能力。观察两组rs55821288位点等位基因分布情况；观察两组rs55821288位点基因型分布情况；观察两组MMSE评分和ADAS-Cog评分变化；观察两组QOL-AD评分和ADL评分变化；分析rs55821288位点等位基因与MMSE和ADAS-Cog相关性；分析rs55821288位点基因型分布与MMSE和ADAS-Cog相关性。结果 AD组rs55821288位点A等位基因频率显著高于对照组(P<0.05)。AD组rs55821288位点AA基因型频率显著高于对照组(P<0.05)。AD组MMSE评分和ADAS-Cog评分显著低于对照组(P<0.05)。AD组QOL-AD评分和ADL评分显著低于对照组(P<0.05)。经Pearson分析显示，rs55821288位点A等位基因与MMSE和ADAS-Cog呈线性负相关(P<0.05)。经Pearson分析显示，rs55821288位点AA基因型分布与MMSE和ADAS-Cog呈线性负相关(P<0.05)。结论 Ghrelin等位基因A及基因型AA对老年痴呆患者认知功能具有促进作用，且与认知功能密切相关。

关键词：
单核苷酸多态性
痴呆
认知功能
阿尔茨海默病
饥饿素基因
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阿尔茨海默病(AD)又称老年性痴呆症，是一种多因素进行性神经系统退行性疾病，临床上主要症状表现为记忆力和认知缺陷[1]。据统计，截止于2019年全球AD患者超4 000万例，而我国是全球AD患者数量最多的国家。我国AD患者占世界AD患者总人口的1/4[2]。随着病情发展AD患者记忆力减退、语言障碍、视觉空间技能损害、思维迟钝、注意力散漫和情感障碍及人格变化等特点，同时伴随社会活动能力和自身生活能力的减退，严重影响患者日常生活活动乃至威胁患者生命安全，同时给社会和家庭带来极大的压力与负担[3,4,5]。但对于AD的发病原因和机制还不确定，无法在早期快速便利确诊，也无特效治疗方法。饥饿素(Ghrelin)是一种含有28个氨基酸的功能性激素，主要作用于下丘脑，通过结合G-蛋白耦联受体(GHSR-1a)调控大脑边缘系统-下丘脑-垂体-肾上腺皮质(LHPA)轴的激素分泌[6]。Ghrelin与肥胖症和代谢综合征有关但也与神经保护、记忆和学习有关[7]。本研究旨在探讨Ghrelin基因单核苷酸多态性(SNP)与老年痴呆及认知功能的相关性。

1、资料与方法

1.1临床资料

选择温州医科大学附属康宁医院于2021年6月至2023年6月收治的老年AD患者100例，其中男63例，女37例；年龄65～79岁，平均(71.32±5.42)岁；病程1～12年，平均(6.32±1.65)年。另选择健康体检老年人72例对照组，其中男47例，女25例；年龄65～78岁，平均(71.54±6.57)岁。两组一般资料无统计学差异(P>0.05)。纳入标准：(1)符合国际疾病分类第10版(ICD10)痴呆标准(研究用);(2)简易智力状态检查(MMSE)量表评分<24分；(3)躯体功能正常；(4)签署知情同意书。排除标准：(1)肝肾功能不全；(2)恶性肿瘤；(3)视听功能不全；(4)并发脑外伤、脑卒中等其他中枢神经系统疾病；(5)存在沟通交流严重障碍者。

1.2 Ghrelin基因SNP分析

(1)DNA抽提：参照OMEGA公司的SE Blood DNA Kit试剂盒说明书从被试全血标本中提取基因组DNA。具体步骤：取无菌1.5 ml小离心管一只，加入300μl待测血液，再加入900μl细胞裂解液；室温孵育10 min(期间颠倒离心管2～3次混匀)裂解红细胞，然后以6 000 r/min室温离心20 s;尽可能将上清移弃干净，勿搅动白色沉淀；重复加入细胞裂解液，室温孵育后离心，弃掉上清；使用涡旋振荡器剧烈混匀，直至白细胞重悬；向重悬细胞溶液中加入核裂解液300μl;加入2μl RNaseA溶液，混匀后，室温反应10 min;加入250μl缓冲液BL放于65℃水浴箱中10 min,期间拿出震荡3次；加入250μl无水乙醇，涡旋震荡；将上述液体移至试剂盒配套的HiBind DNA管里，然后1 500 r/min室温，离心1 min;加入500μl HB缓冲液，1 500 r/min室温离心1 min,弃液，重复1次；3 000 r/min室温，离心2 min;将HiBind DNA管放入新的EP管内，加入50μl 65℃的洗脱缓冲液，65℃反应5 min后，3 000 r/min室温，离心1 min;再加入50μl 65℃的洗脱缓冲液，65℃反应5 min后，3 000 r/min室温，离心1 min;最后EP管内为提取的基因组DNA。(2)聚合酶链反应(PCR)扩增：根据选取的SNP位点设计引物，以Ghrelin基因的DNA片段为模版，进行聚合酶链式反应。反应体系体积为40μl,反应条件：96℃预处理5 min, 96℃变性30 s,退火温度为53℃,退火时间为30 s, 72℃延伸30 s,共35个循环，最后72℃延伸5 min。PCR产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳(100 V)检测(96℃高温使双链DNA解离形成单链，退火53℃使引物与模板DNA互补区结合，中温72℃使DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应)。(3)酶切验证：根据SNP位点多态性设计选取合适的酶进行酶切验证。(4)序列分析：将PCR扩增后所得基因序列交由上海生工生物公司测定序列后进行分析。

1.3认知功能评估

(1)MMSE:评分0～30分，评分越高认知功能越好，MMSE评分≥27分表示认知功能正常，MMSE评分<27分表示认知功能障碍。以MMSE评分21～26分为轻度认知功能障碍，10～20分为中度认知功能障碍，0～9分为重度认知功能障碍。(2)AD评定量表-认知(ADAS-Cog)量表评定：ADAS-Cog评分0～70分，评分越高认知功能越好。

1.4生活能力评估

采用痴呆患者生活质量量表(QOL-AD)和日常生活活动能力(ADL)评价。其中QOL-AD评分13～52分，评分越高生活质量越好；ADL评分，0～100分，评分越高生活质量越好。

1.5统计学方法

采用SPSS26.0软件行χ2检验、t检验和Pearson相关性分析。

2、结果

2.1两组rs55821288位点等位基因分布情况比较

AD组rs55821288位点A等位基因频率高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2两组rs55821288位点基因型分布情况比较

AD组rs55821288位点AA基因型频率高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1两组rs55821288位点等位基因、基因型分布比较[n(%)]

2.3两组MMSE和ADAS-Cog、QOL-AD、ADL评分比较

AD组MMSE、ADAS-Cog、QOL-AD、ADL评分低于对照组，差异有统计学意义(P<0.001),见表2。

表2两组MMSE、ADAS-Cog、QOL-AD、ADL评分比较

2.4 Pearson相关性分析

rs55821288位点A等位基因与MMSE和ADAS-Cog呈线性负相关(r=-0.574、-0.651,均P<0.001)。rs55821288位点AA基因型分布与MMSE和ADAS-Cog呈线性负相关(r=-0.607、-0.718,均P<0.001)。

3、讨论

AD是由遗传、环境等因素引起的一种常见的神经内科疾病，具有病程长、逐步进展等特点，易不可逆损伤患者生活质量和社会功能，降低患者日常生活能力，且随着病情发展将逐渐减退患者生活质量[8,9,10]。AD患者会表现出不同程度认知功能障碍，而认知功能损害多与炎性损伤、神经变性及神经内分泌有关[11,12]。现阶段，针对老年AD患者仍以药物治疗为主，但采用药物治疗虽可改善患者临床症状，延长生存时间，但常需终身服药，患者沟通障碍且依从性差，常不配合治疗[13,14,15]。本研究表明，老年痴呆患者存在明显的认知功能障碍；生活能力明显下降。

Ghrelin主要来自胃黏膜A或X/A样细胞，是从胃组织中分离出的一种生长素释放肽，也是脂肪细胞因子之一。Ghrelin作用除促进生长激素释放外，还可调节能量代谢，影响葡萄糖代谢和胰腺的内分泌功能。Ghrelin还可通过抑制脂肪分解和刺激脂肪生成，从而促进内脏组织中血浆非酯化脂肪酸的储存。此外，Ghrelin对能量自稳态、脂代谢及糖代谢具有重要调节作用，还可以与抵抗素和瘦素等脂肪因子相互作用，从而调节细胞的胰岛素敏感性[16]。Ghrelin与肥胖症和代谢综合征有关[17,18],但也与神经保护、记忆和学习有关[19]。AD早期的一个特征是海马退化，而Ghrelin被证实对海马神经元具有保护作用。已有实验证明Ghrelin参与了许多更高的大脑功能，如记忆、奖励和睡眠等[20]。Ghrelin基因rs55821288位点主要位于第4内含子，包含G和A两种等位基因。目前，临床上尚无有关Ghrelin基因rs55821288位点与老年痴呆患者认知功能方面的研究，缺乏可靠临床参考依据。本研究表明，A等位基因可能是PCOS发病的危险因素；老年痴呆患者rs55821288位点AA基因分布明显增加。但本研究入组样本量相对较小，可能会造成研究结果存在偏倚，故还需笔者后续增加病例，进一步探讨Ghrelin基因多态性与老年痴呆及认知功能相关性，以期提供可靠临床参考依据。综上，Ghrelin等位基因A及基因型AA对老年痴呆患者认知功能具有促进作用，且与认知功能密切相关，具有重要临床研究价值。

参考文献:

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