阿尔茨海默症(Alzheimer′s disease, AD)是一种常见的神经系统退行性疾病，其主要表现为认知功能障碍、记忆功能下降、智力减退及人格改变[1],且与遗传及年龄有着密切的关系[2]。2019 年《世界阿尔茨海默病报告》显示，全世界AD患者人数已超过5 000万，预计到2050年将增加至15 200万[3]。 由于AD发病的复杂性，目前临床上治疗AD的药物只有乙酰胆碱酯酶抑制剂和N-甲基-D-天门冬氨酸受体拮抗剂两类，尚不能阻止AD的发生发展或根治AD[4]。

在中医学中，AD 归于“好忘、喜忘、健忘、呆痴、愚痴”等病的范畴， 《医述》中所述：“脑为髓海”因而“聪明焉”,因为脑控制着人的整个身体运行，脑髓清，人才能思维敏捷，有良好的记忆力。因脾主运化水谷、主阳气，而清阳之气上升于脑，故而清髓的能量来自于脾。若脾虚且无以化生，阴精阴血耗损不足，终致髓减脑消，神机失用，最终发展为痴呆[5]。四君子汤始载于《太平惠民和剂局方》,为经典补脾方药，由人参、白术、茯苓、甘草组成[6]。四味药材皆为平和之品，四药相辅，突出益气健脾之功效。除了治疗脾胃气虚之外，近年来有研究[7,8]发现四君子汤能调控促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)、葡萄糖转运蛋白1 (glucose transporter type 1,GLUT1)、低密度脂蛋白受体相关蛋白1 (recombinant low density lipoprotein receptor related protein 1,LRP1)和晚期糖基化终末产物受体信使核糖核酸(receptor for advanced glycation endproduct messenger RNA, RAGE mRNA )的表达，从而对 AD 模型小鼠发挥脑保护作用。但目前四君子汤治疗AD的作用机制尚不明确。

网络药理学基于生物数据库信息及组学实验数据，可用于预测药物的有效成分活性及其参与机体生物学过程中的重要作用靶点及作用通路[9],本研究拟结合网络药理学，分析四君子汤的有效活性成分、筛选四君子汤抗AD的作用靶点、挖掘其潜在通路，并辅以动物实验进行初步验证，以期为进一步开展相关理论研究及实验提供参考。

1、材料与方法

1.1 四君子汤有效成分及靶点的筛选

从TCMSP数据库筛选四君子汤化学成分，通过TCMSP数据库、ETCM数据库中筛选相关靶点。采用Uniprot数据库将靶蛋白名转换为标准基因靶点名称。

1.2 AD疾病相关基因检索

在DisGeNET数据库中以得分>0.1作为筛选条件选择相关基因，在GeneCards数据库则选择相关性分数(relevancescore)≥30的基因，将两个数据库合并去重从而获得最终AD的相关靶点。

1.3 共有靶点PPI

网络的构建及可视化处理通过String数据库,构建共同靶点的相互作用(protein-protein interaction, PPI)网络，用Cytoscape进行可视化处理。

1.4 交集靶点的功能富集分析

采用DAVID数据库对交集靶点蛋白进行基因本体(GO)富集分析、基因组学百科全书(KEGG)通路富集分析。

1.5 网络构建

将四君子汤中药、有效成分、对应靶点、疾病导入Cytoscape 3.7.1,构建四君子汤中药-成分-靶点-疾病网络。

1.6 实验验证

1.6.1 动物

24只3月龄SPF级APP/PS1双转基因雄性小鼠，及8只同品系同月龄SPF级C57BL/6雄性小鼠，均购自杭州子源实验动物科技有限公司，许可证号为SCXK(浙)2019-0004,动物饲养于SPF级动物房内。

1.6.2 药物

将人参、白术、茯苓、甘草以3∶3∶3∶2的比例混合，先用蒸馏水按照料液比1∶10浸泡60 min, 再煎煮45 min, 滤除药液，保存，再加8倍蒸馏水煎煮45 min, 两次煎煮药液混合并浓缩，配置成1 g/mL、0.25 g/mL的药液，放置4℃冰箱保存，给药前复温。

1.6.3 试剂与仪器

BCA蛋白浓度测定试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性检测试剂盒、乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, AchE)活性检测试剂盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量检测试剂盒购自北京索莱宝公司(批号：PC0020、BC0170、BC2025、BC0020)。

1.6.4 动物分组及给药

将24只APP/PS1小鼠随机分为模型组和低、高剂量实验组，每组8只；另取8只C57BL/6小鼠作为阴性对照组。低、高剂量实验组分别给予2.50 g·kg-1·d-1和10 g·kg-1·d-1四君子汤水提液，对照组和模型组均给予等量蒸馏水。4组小鼠每天灌胃1次，连续4个月。

1.6.5 Morris水迷宫实验

采用Morris水迷宫检测小鼠记忆能力和空间探索能力。给药6 d后检测3次。

1.6.6 小鼠生化指标检测

小鼠行为学实验结束后立即冰上处死，取小鼠大脑组织，按照试剂盒说明书进行组织裂解，测定小鼠脑组织SOD、AChE、MDA的含量。

1.7 统计学方法

采用SPSS 26.0统计学软件进行统计分析，定量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 四君子汤有效成分

从TCMSP中以口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%,类药性(druglikeness, DL)≥0.18 为条件，最终筛选出128个有效成分。

2.2 四君子汤治疗AD潜在靶点的预测

共得到了242个靶点蛋白，潜在靶点基因2 898个，将预测基因与疾病靶点基因取交集，得到49个有关四君子汤治疗AD的作用靶点。

2.3 PPI网络构建图

PPI网络构建结果得出节点数49、边数581、平均节点度23.7、平均局部聚类系数0.76。见图1。

2.4 共同靶基因的生物功能及相关通路的富集分析

GO富集结果涉及的生物过程(biological process, BP)主要包括老化、凋亡过程、MAPK的正调控、对氧化应激的反应、基因表达的正向调节、活性氧代谢过程的正向调节、细胞氧化还原、清除过氧化物自由基等；细胞组成(cell composition, CC)包括胞外区、线粒体、溶酶体、线粒体外膜、脂筏等；涉及的分子功能(molecular function, MF)包括蛋白激酶结合、细胞因子活性、参与细胞凋亡执行阶段的半胱氨酸型内肽酶活性、β淀粉样蛋白结合、生长因子活性、转录调节区序列特异性DNA结合、乙酰胆碱结合、氧化还原酶活性。KEGG信号通路主要是富集在癌症通路、神经退行性变、脂质与动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B,PI3K-AKT)信号通路等。

2.5 构建并分析“中药-活性成分-共同靶点-疾病”网络

“中药-活性成分-共同靶点-疾病”网络共由 164 个节点及2 010条连边组成，该网络关键化学成分有驴食草酚、甘草醇、美迪紫檀素等。关键靶点有重组人分泌型磷蛋白1(secreted phosphoprotein 1, SPP1)、肾上腺素能受体(alpha 2A adrenergic receptor, ADRA2A)、对氧磷酶1(recombinant paraoxonase 1, PON1)等。

图1 PPI网络构建图   

图2 四君子汤AD 的“中药-成分-靶点-疾病”网络   

2.6 实验结果

2.6.1 四君子汤对阿尔兹海默症小鼠认知功能的影响

2.6.1.1 Morris水迷宫实验定位航行实验结果

在第1～2天，各组小鼠逃避潜伏期比较，差异无统计学意义。第3～5天，与阴性对照比较，模型组逃避潜伏期时间明显增长(P<0.01)。与模型组比较，四君子汤低剂量组、高剂量组小鼠逃避潜伏期均有显著缩短(P<0.01)。见表1。

2.6.1.2 Morris水迷宫空间探索实验结果

在第6天时，空间探索实验结果显示， 与阴性对照组比较， 模型组原象限滞留时间、小鼠穿越平台次数明显下降(P<0.05) ;与模型组比较， 四君子汤低剂量组、高剂量组原象限滞留时间、小鼠穿越平台次数明显上升 (P<0.01)。见表1。

2.6.2 四君子汤对脑组织病理学的影响

正常组小鼠海马线粒体形态正常，双层膜结构明显，嵴清晰。模拟组小鼠海马线粒体严重空泡化，膜不清，嵴断裂。胞质内可见较多的脂褐素小体、脂滴；与模型组相比较，四君子汤低剂量组、高剂量组胞质内脂褐素较少，线粒体双层膜结构清晰，大部分线粒体结构完整，嵴较为清晰。见图3。

表1 Morris 水迷宫实验实验结果

图3 小鼠海马组织电镜检测   

2.6.3 四君子汤对阿尔兹海默症小鼠氧化应激的影响

与阴性对照组相比，模型组AChE 、MDA的水平明显上升(P<0.05),而SOD的活性明显下降(P<0.05)。与模型组比较，四君子汤低剂量组、高剂量组AChE、MDA水平明显下降，SOD水平明显上升(P<0.05),且高剂量组效果更为明显。见表2。

表2 氧化应激生化指标结果

3、讨论

目前，西医对AD病因及其发病机制仍未完全阐明，尚无根治AD的药物[10]。AD复杂的病理过程让研究者们联想到中药治疗疾病的“整体论”及“辨证论治”的理念。《内经》中写道 “肾为先天之本，脾为后天之本”,《医林改错》阐述道“灵机记性在脑者，因饮食而生气血，长肌肉，精汁之清者，化而为髓，由脊骨上行入脑，名曰脑髓”。表明对脾胃的治疗对于AD的治疗具有指导意义。

根据OB和DL参数，本研究共筛选出四君子汤可能的活性成分128个，其中驴食草酚、甘草醇、美迪紫檀素、甲氧基光甘草定、高丽槐素、亚胺异鼠李素、(-)-药果芸香碱、牛磺酸等化合物可能是四君子汤治疗AD的重要活性成分。已有报道证实，甘草醇能减少大脑细胞受氧化物的损伤从而起到保护中枢神经而增强记忆力的作用[11];亚胺异鼠李素具有抑制氧化应激和抑制线粒体凋亡通路的作用[12]; 牛磺酸具有清除氧自由基、抑制脂质过氧化等广泛的生物学功能[13]。另外，GO 富集结果与KEGG 通路富集结果均提示四君子汤具有多靶点、多途径的特点。

四君子汤治疗AD可能的靶点49个，包括AKT1、半胱天冬酶-3(caspase-3,CASP3)、肿瘤坏死因子( tumor necrosis factor, TNF)、白介素6(interleukin- 6,IL6)、IL1B、血管内皮生长因子A (vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、肿瘤抑制蛋白P53(tumor protein p53,TP53)、过氧化物酶体增生激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma, PPARG)、转录后基因沉默2(post-transcriptional gene silencing 2,PTGS2)、一氧化氮合酶3(nitric oxide synthase 3,NOS3)等核心靶点。有研究证实AKT1是AD的靶基因，并表明AKT的磷酸化与AD认知功能低下有关，且活性氧介导的突触AKT1信号缺失会导致阿尔茨海默病早期活性依赖蛋白翻译缺陷[14,15];Casp3是细胞凋亡途径中最关键的酶之一，大量研究证实Casp3的活化可诱导AD神经元凋亡，而抑制Casp3的活化则可改善AD病理损伤[16,17,18]。TNF是一种多功能促炎细胞因子，参与调节多种生物过程，包括细胞增殖、分化、凋亡等，TNF的突变会影响 AD 的易感性，相关研究表明抑制 TNF-α 对预防AD具有治疗潜力[19];IL6的基因多态性也可能影响AD的易感性[20];IL-1B作为促炎因子的积累可能损伤神经元细胞， 引起神经元炎，从而导致记忆和学习的海马依赖性损伤[21]。

四君子汤治疗AD主要涉及PI3K-AKT信号通路及AGE-RAGE信号通路等。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)可与生长因子结合，使AKT磷酸化，AKT活化后激活或抑制其下游底物，起到调节细胞生长、分化、凋亡的作用[22]。有研究表明，PI3K/AKT信号通路在脑部病变中的氧化应激和炎症反应中发挥重要作用[23];2型糖尿病(diabetes mellitus type 2,T2DM)被认为是AD的加速器[24],高糖状态下AGEs-RAGE大量聚集产生ROS,导致细胞不可逆损伤及神经元数量减少[25], 四君子汤可能通过下调脑内AGEs-RAGE的结合，使ROS生成减少，纠正突触神经元损伤，从而改善认知功能。

本研究采用网络药理学结合生物信息学的方法探讨了四君子汤治疗AD 可能的潜在作用机制，验证了四君子汤对AD的治疗作用，并初步阐释了四君子汤治疗 AD 多成分、多靶点、多途径的作用特点，课题组拟在后续研究中基于线粒体自噬进一步探讨四君子汤治疗AD的作用机制、物质基础及现代剂型开发。

参考文献:

[5]杨佳一,赵俊,田会玲,等.“脾肾互赞”理论在阿尔茨海默病治疗中的应用[J].世界科学技术-中医药现代化,2020,22(8):2607-2614.

[6]巩子汉,段永强,杨晓轶,等.四君子汤对大鼠学习记忆能力的影响机制[J].中国临床药理学杂志,2020,36(10):1333-1336.

[9]毛丽斯,朱晓红.网络药理学在中药领域的应用进展[J].中医药管理杂志,2021,29(13):98-102.

[11]崔永明,余龙江,丁巧,等.甘草醇提物对大鼠学习记忆障碍的影响[J].中国老年学杂志,2008(12):1055-1057.

[13]罗璨,郭莲军.牛磺酸对大鼠急性脑缺血神经元凋亡的影响[J].中国药理学通报,2005,21(9):1057-1061.

[22]张建云,李婧雯,张丽红,等.PI3K/Akt信号通路与缺血性脑卒中的关系及中药干预的研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(22):265-275.

[23]刘玥彤,蒙兰青,刘佩,等.基于网络药理学及分子对接技术探讨中药治疗脑卒中作用机制的研究进展[J].右江民族医学院学报,2021,43(6):810-814.

[25]李孟媛,黄海鹏,姚琳,等.针刺治疗2型糖尿病认知功能障碍的潜在作用机制分析[J].中华中医药杂志,2021,36(12):7239-7242.

基金资助:烟台市重点研发计划(2019XDHZ107);山东省大学生创新创业训练计划(S202110440022);滨州医学院大学生创新创业训练计划(X202210440328);

文章来源:王彦君,张清,马辉等.基于网络药理学和实验验证四君子汤治疗阿尔茨海默病的作用机制[J].滨州医学院学报,2024,47(02):142-146.