首页 > 论文范文 > 自然科学论文 > 生物学论文 > 病毒学论文 > 猴痘病毒mRNA疫苗的构建及免疫评价

猴痘病毒mRNA疫苗的构建及免疫评价

2024-02-26 9 上传者：管理员

摘要：目的设计猴痘病毒(MPXV)抗原，选择多种方案设计抗猴痘病毒mRNA候选疫苗，并完成其表达鉴定及小鼠体内的免疫效果评价。方法选取猴痘病毒M1R、A35R、A29L、H3L基因设计三组候选抗原基因(命名为：M1R-A35R、A29L-H3L-A35R、A35R-Fc),并设置一组痘苗病毒(VACV)基因(L1R-A33R)作为对照，分别连接至mRNA制备专用载体pGEM-3Zf-n3,通过线性化、体外转录、纯化和加帽获得功能性mRNA,利用Western blot、IFA对目的抗原进行鉴定。通过微流控芯片制备LNP-mRNAs疫苗，制定免疫程序并完成小鼠的免疫及特异性抗体水平监测。结果成功构建3组抗猴痘病毒的mRNA疫苗和1组抗痘苗病毒的mRNA疫苗，四组疫苗均能表达抗原蛋白，并且制备的4组LNP-mRNAs疫苗在免疫后84 d仍维持较高的特异性抗体水平。结论成功完成猴痘病毒mRNA疫苗的构建、表达及鉴定，并通过对不同猴痘病毒抗原设计的验证，为以后猴痘疫苗的研发提供数据支撑。

关键词：
EEV
IMV
LNP-mRNAs
mRNA疫苗
猴痘病毒
痘苗病毒
加入收藏

猴痘病毒(Mpox virus, MPXV)属于痘病毒科、正痘病毒属[1,2]。在正痘病毒属家族中只有天花病毒、牛痘病毒、痘苗病毒(vaccinia virus, VACV)和猴痘病毒四种可以引起人类感染，它们的抗原性质基本相同，彼此之间有交叉免疫性[3,4]。猴痘病毒外形为圆角砖形或卵圆形，是双链DNA病毒[5,6],在其复制周期中能产生两种不同形式的病毒颗粒，细胞外包膜病毒(extracellular enveloped virus, EEV)和细胞内成熟病毒(intracellular mature virus IMV,IMV)。虽然这两种形式都能够感染宿主，但EEV和IMV颗粒具有不同的表面蛋白组成，因此具有不同的免疫原性和传染性[7]。其中MPXV在成IMV表面上有大约20种蛋白质，在EEV上有另外6种蛋白质[8],这些蛋白具有复杂的相互作用，可广泛入侵细胞和宿主，有的蛋白产生的抗体可以中和病毒[9,10,11,12,13,14],有的被证实是病毒进入细胞所必需的包膜蛋白[15]。与单独使用相比，IMV和EEV靶点的组合可提供更好的保护[16,17,18]。

A29L蛋白作为VACV中A27L的同源蛋白，参与病毒附着于宿主细胞膜，这些蛋白质是基因转录所需的转录因子和病毒复制所需的酶[19]。A27L蛋白的的某些肽段被证实是CD4+、CD8+的T细胞表位[20,21,22]。而A29L蛋白上的表位(21～49aa)与糖胺聚糖(GAGs)结合区相邻，是单克隆抗体的靶标，可以中和病毒颗粒来干扰病毒对宿主细胞表面的粘附[23]。M1R是VACV中L1R的同源蛋白。L1R位于IMV膜上，是中和单克隆抗体的靶标，并且L1R蛋白的适当折叠对于诱导中和抗体至关重要[24,25],所以同源的M1R也可能具有此功能。H3L蛋白可以通过其C端疏水结构附着在病毒包膜膜上，并与细胞表面的HS结合，促进病毒进入[26]。H3L蛋白是细胞免疫应答的靶标，对于触发宿主细胞产生T细胞和B细胞免疫反应至关重要。此外，该蛋白产物也是中和抗体的主要靶点[27]。A35R是VACV中A33R同源蛋白。A33R蛋白在脂质膜表面表达，而在IMV表面不表达[28]。A33R是排除重复感染所必需的蛋白[29]。此外，在补体存在的情况下，A33R是中和脂质膜抗体反应的靶标[30]。尽管MPXV和VACV的基因具有高度同源性，但这些蛋白质之间的差异可能影响天花疫苗对MPXV的交叉保护。因此，开发一种针对MPXV的多种抗原结合的疫苗，将对抑制猴痘疫情的爆发提供更强的保护[31,32]。

本研究选用猴痘病毒的M1R、A35R、A29L、H3L作为猴痘mRNA疫苗靶抗原，其中三组mRNA候选疫苗(M1R-A35R、A29L-H3L-A35R、L1R-A33R)均涵盖了IMV和EEV蛋白，旨在提高疫苗的免疫效果。本文通过构建多种抗原设计形式的猴痘病毒mRNA候选疫苗，为后续猴痘病毒mRNA疫苗的进一步抗原设计提供数据支撑。

1、材料与方法

1材料

限制性核酸内切酶PacⅠ、ClaⅠ、XhoⅠ购自美国NEB公司；PEIpro购自法国Polyplus公司；His特异性抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；T7体外转录试剂盒、加帽试剂盒购自美国cell script公司；纯化试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司；A35R蛋白购自北京百普赛斯生物科技有限公司；质粒pGEM-3Zf-n3由长春兽医研究所分子病毒学与免疫学实验室设计并保存。

2基因的合成

利用NCBI网站查询猴痘MPXV和VACV的基因序列，设计M1R-A35R、A29L-H3L-A35R、A35R-Fc和L1R-A33R四组候选疫苗基因(图1)。送往南京金斯瑞生物科技股份有限公司合成。

图1动物实验流程

3重组质粒的构建及鉴定

将M1R-A35R、A29L-H3L-A35R、A35R-Fc和L1R-A33R通过限制性内切酶PacⅠ和ClaⅠ连接至pGEM-3Zf-n3载体。连接体系为：T4连接酶1μL,T4连接酶buffer 1μL,目的基因4μL,载体4μL,反应条件：16℃16 h。将扩大培养的菌液按照无内毒素大提试剂盒说明书进行质粒的提取，提取的质粒利用PacⅠ酶和ClaⅠ酶进行双酶切验证。双酶切体系为：限制性内切酶PacⅠ和ClaⅠ各0.5μL,重组质粒(pGEM-n3-L1R-A33R;pGEM-n3-SP-M1R-A35R;pGEM-n3-A29L-H3L-A35R;pGEM-n3-A35R-Fc)2μg, 10×CutSmart Buffer 1.25μL,加水补足至12.5μL,反应条件：37℃4 h。

4重组质粒的线性化

利用限制性内切酶XhoⅠ将重组质粒单酶切，获得线性化的重组质粒，并利用胶回收实验回收线性化的产物。单酶切体系为：限制性内切酶XhoⅠ2μL,重组质粒(pGEM-n3-L1R-A33R;pGEM-n3-SP-M1R-A35R;pGEM-n3-A29L-H3L-A35R;pGEM-n3-A35R-Fc)8μg, 10×CutSmart Buffer 5μL,加水至50μL,每个质粒重复3个体系，反应条件：37℃4 h(图3)。

图3重组质粒双酶切鉴定

5体外转录、纯化及加帽

选用T7-Flash ScribeTM Transcription Kit试剂盒对线性化质粒进行体外转录，期间将UTP替换为N1-Methylpseudouridine-5′-Triphosphate。选用MEGAclearTM Kit Purification for Large Scale Transcription Reactions试剂盒对体外转录产物进行纯化。mRNA加帽反应选用Script CapTM Cap 1 Capping System,其加帽产物标记为Cap-mRNAs,以上所有操作均参照试剂盒说明书。

6 Cap-mRNAs的功能验证

6.1蛋白质免疫印迹试验(Western blot)

将293T细胞以1×105个/孔接种于24孔板，当细胞密度达到80%时，将培养基更换为无血清培养基，然后将转染试剂PEI pro和Cap-mRNAs按照体积与质量比为1μL∶2μg的比例混匀，室温静置15 min后滴入孔中，放入温箱继续培养24 h,收取细胞。使用RIPA细胞裂解液裂解，收取裂解液并加入5×SDS Loading Buffer重悬，在沸水中煮样10 min,进行SDS-PAGE电泳。然后用5%脱脂乳室温封闭2 h,分别选用鼠源His抗体、鼠源β-Actin抗体、兔源GAPDH抗体在室温下孵育60 min;洗膜3次后加入HRP标记的山羊抗小鼠/山羊抗兔Ig(H+L)抗体，室温孵育30min,最后洗膜显色并拍照。

6.2间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay, IFA)

将293T细胞以2×104个/孔接种于96孔板，当细胞密度达到80%时，将培养基更换为无血清培养基，将转染试剂PEIpro和Cap-mRNAs按照体积与质量比为0.5μL∶0.25μg的比例混匀，室温静置15 min后滴入孔中，放入温箱继续培养24 h。转染24 h后弃去细胞废液并使用4%多聚甲醛固定液固定10 min, PBST洗涤2次，3 min/次；使用3%BSA封闭液室温作用30 min,洗涤2次；加入鼠源His抗体，37℃孵育1 h,洗涤3次；加入Cy3标记山羊抗鼠Ig(H+L)抗体，37℃孵育30 min,洗涤4次；加入DAPI染色液进行细胞核染色，室温放置3～5 min,洗涤2次，荧光显微镜下观察结果并拍照。

7 LNP-mRNAs候选疫苗免疫C57BL/6小鼠

7.1免疫程序

选择6周龄雌性C57BL/6小鼠，随机分为4组，每组6只。分别为LNP/mM1R-A35R、LNP/mL1R-A33R、LNP/mA29L-H3L-A35R、LNP/mA35R-Fc;两组LNP和PBS对照组。免疫方式为肌肉注射，mRNA的剂量为10μg/只、LNP组即为材料组5μL/只、PBS组150μL/只。首次免疫后第14 d加强免疫一次，第28 d再次加强免疫一次。首次免疫后分别在第14、28、42和84 d采集小鼠血液。

7.2酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosor-bent assay, ELISA)

采用间接ELISA法检测小鼠血清中的特异性抗体水平。首先，将A35R蛋白溶解后，用ELISA包被液将蛋白终浓度稀释至5μg/mL,酶标板中每孔加100μL,4℃过夜敷育。取出包被好的酶标板，弃去板内液体拍干，每孔加入300μL的3%的BSA进行封闭，37℃敷育2 h。弃液，使用PBST洗板，每孔300μL,3 min/次，共洗2次。洗板完毕后，将板内液体拍干。然后加入待检测血清，待检测血清用PBS按1∶100进行稀释，每孔100μL,37℃孵育1 h。洗涤三次后，每孔加入100μL的辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗小鼠IgG(1∶7 500稀释),37℃孵育1 h。洗涤三次后拍干，每孔加入100μL四甲基联苯胺(TMB)显色液，室温避光孵育3～5 min后每孔加入50μL的ELISA终止液中止，最后用酶标仪检测A450并记录读数。

2、结果

1基因合成

共合成了4条目的基因，分别为L1R-A33R、M1R-A35R、A29L-H3L-A35R、A35R-Fc。基因中包含目的基因、信号肽(signal peptide, SP)、接头序列(Linker)和Fc段基因序列(图2)。

图2基因结构

2重组质粒的鉴定

经PacⅠ和ClaⅠ双酶切处理后得到的酶切产物与预期片段大小相符(M1R-A35R:1 268 bp; L1R-A33R:1 286 bp; A29L-H3L-A35R:2 078 bp; A35R-Fc: 1 376 bp)(图3)。

3重组质粒的线性化

经XhoⅠ单酶切处理后得到的酶切产物与预期片段大小相符(pGEM-n3-M1R-A35R:4 940 bp; pGEM-n3-L1R-A33R:4 958 bp; pGEM-n3-A29L-H3L-A35R:5 748 bp; pGEM-n3-A35R-Fc: 5 048 bp)(图4)。

图4重组质粒线性化

4 Western blot验证目的基因的表达

结果表明，Cap-mRNAs转染293T细胞24 h后均可检测到His蛋白，由于融合蛋白使用了可剪切Linker连接，致使蛋白在Linker处发生剪切，导致鼠源的His抗体无法检测整个融合蛋白，只能检测到与His连接的蛋白，所以SP-M1R-A35R-His的实际值为23.02 ku, SP-L1R-A33R-His的实际值为23.50 ku, SP-A29L-H3L-A35R-His的实际值为22.89 ku, SP-A35R-Fc-His蛋白的实际值为49.73 ku。(图5)。

图5 Western blot检测His标签蛋白

5 IFA检测His标签蛋白

IFA结果表明，mRNA转染细胞后均检测到目的蛋白的表达，荧光显微镜下显示红色荧光，而对照组未检测到荧光(图6)。

图6间接免疫荧光法检测His标签蛋白

6 LNP-mRNAs候选疫苗免疫C57BL/6小鼠血清特异性抗体水平检测

ELISA结果显示，与对照组(PBS与LNP)相比，实验组在免疫后第28 d即二免二周后产生特异性抗体，其中LNP/mA29L-H3L-A35R在二免二周时即可达到峰值，A450值>3;和LNP/mA35R-FC和LNP/mM1R-A35R在三免二周达到峰值，A450值>2.5;LNP/mL1R-A33R在三免八周到达峰值A450值>1.5。通过长期监测发现，LNP/mRNAs可以在一免后的第84 d仍然维持一个较高的特异性抗体水平(图7)。说明LNP/mRNAs不仅能产生较高的特异性抗体，而且还能将较高的抗体水平维持至少3个月的时间。

图7小鼠血清中特异性抗体水平检测

3、讨论

猴痘病毒为动物源性病毒，1958年偶然在实验动物猴子身上被发现[33,34]。该病于1970年初次在人类中发现，主要见于非洲中西部雨林国家，表现为皮肤出现类似天花的水疱或脓疱、发热等。2003年5月，在非洲大陆以外发现首例病例[35],到2022年5月，多个猴痘非流行国家报道了猴痘确诊病例，说明猴痘疫情正逐渐向世界范围蔓延。2023年9月15日国家卫生健康委发布公告，自2023年9月20日起将猴痘纳入乙类传染病进行管理。2022-2023年9月27日全球感染MPXV人数为90 618,死亡157人，疫情波及115个国家。其中，中国感染MPXV人数为1 484,无死亡病例，感染患者多数为男性。

猴痘病毒包括分支I和分支II[36]。当前的猴痘疫情主要由Ⅱb分支的病毒株引起的，相较于分支Ⅰ型，其致死率更低。截至目前，全球仅有一家有批准上市的猴痘疫苗，该疫苗是以牛痘安卡拉病毒(IMVA-BN)为基础研发了非复制型天花-猴痘疫苗[37,38]。改良之后的疫苗在人类细胞不再具有繁殖复制的能力[39,40],提高了疫苗的安全性和有效性[40,41]。但是其保护靶点尚未确定，因此它们仅被用于高危人群的暴露前预防。

猴痘病毒同其他痘病毒类似，存在广泛的血清学交叉反应和核酸的同一性，所以在猴痘疫苗研发过程中，可利用其他痘病毒来评价猴痘疫苗的免疫效果。在疫苗类型选取上，mRNA疫苗具有非整合的、非传染性的、耐受性良好，在细胞中表达时间短，利于重复接种。并且IVT-mRNA的生产不需要细胞，防止了蛋白质或病毒的污染，mRNA疫苗结合相关的递送载体和佐剂，几乎可以诱导体内所有的免疫反应，同时还能诱导机体产生强而持久的免疫应答[41],因此，开发和生产猴痘mRNA疫苗有利于快速、安全和有效的预防猴痘的流行和爆发。

本研究构建了3组含猴痘抗原基因和1组含痘苗抗原基因的的mRNA疫苗，通过WB、IFA证明了制备的mRNA可以成功表达目的抗原。通过疫苗的免疫接种实验，证明了构建的四种LNP/mRNAs疫苗能有效的诱导小鼠体内产生较高而持久的体液免疫应答，由此证明本研究中的抗原设计是可行的，也为今后猴痘mRNA疫苗的抗原设计提供新思路及数据支撑。

参考文献:

[1]苏琳佳,许方,婧伟,等.猴痘病毒疫苗的研究进展[J].微生物学免疫学进展,2022,50(5):1-5.

[3]石建州,王国川,王彦伟,等.猴痘病毒研究进展[J].病毒学报,2022,38(5):1195-1205.

基金资助:国家重点研发计划项目(No.2023YFD1800404);

文章来源:唐家凤,庄忻雨,姜人月等.猴痘病毒mRNA疫苗的构建及免疫评价[J].中国病原生物学杂志,2024,19(03):257-262.