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布鲁氏菌病实验室诊断方法研究进展

2024-04-12 51 上传者：管理员

摘要：布鲁氏菌病是一种人畜共患传染病，病死率较低，但有慢性进展倾向，如不及早明确诊断和治疗，严重者可导致残疾，严重影响生活质量。布鲁氏菌病临床表现无特异性、细菌培养周期较长及血清学诊断方法复杂，不易早期准确诊断。布鲁氏菌病的实验室诊断方法包括细菌培养(诊断金标准)、血清学检测及分子生物学方法，每种诊断方法均有其优缺点和适用性。本文就布鲁氏菌病实验室诊断方法研究进展作一综述。

关键词：
分子生物学
实验室诊断
布鲁氏菌病
细菌培养
血清学
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布鲁氏菌病是全世界严重的人畜共患疾病之一，每年至少新增50万例，多数发生在中东、中亚、印度和南美洲等发展中国家[1]。人类有可能通过直接接触患病动物或食用受污染的牛奶和奶制品或吸入气溶胶等方式感染，常在游牧地区流行，临床表现为发热(波状热)、乏力、关节痛和肌肉疼痛(发生率分别为87%、63%、62%、56%),可能并发脊柱炎、脑膜炎和心内膜炎等，还可能造成不孕、胎儿死亡、妊娠晚期流产等不良结局[2,3]。布鲁氏菌病临床表现非特异性、病原体培养阳性率低，快速和准确诊断对及时抗感染治疗有重要意义，血清学和分子生物学检测在布鲁氏菌病诊断中发挥重要作用[4]。本文就布鲁氏菌病实验室诊断方法研究进展综述如下。

1、布鲁氏菌病实验室诊断方法概述

布鲁氏菌病的实验室诊断方法主要有细菌培养、血清学检测和分子生物学检测。细菌培养被认为是诊断金标准，但其检测周期长、阳性率低、对实验室要求较高；血清学检测价格低廉、方便快速、阴性预测价值高，在流行地区已作为主要诊断工具，但缺乏特异性，疾病早期诊断灵敏度较低；分子生物学检测是一种快速检测方法，灵敏度和特异度较高，但检测序列有限，受仪器设备限制，较难普及[5]。我国布鲁氏菌病诊断行业标准中实验室检查由初筛及确诊实验组成，初筛实验包括：(1)虎红平板凝集试验结果为阳性；(2)胶体金免疫层析试验结果为阳性；(3)ELISA结果为阳性；(4)布鲁氏菌培养物涂片革兰染色检出疑似布鲁氏菌；确诊实验包括：(1)从患者血液、骨髓、其他体液及排泄物等任意一种培养物中分离出布鲁氏菌；(2)试管凝集试验滴度为1∶100及以上，或患者病程持续1年以上且仍有临床症状者滴度为1∶50及以上；(3)补体结合试验滴度为1∶10及以上；(4)抗人球蛋白试验滴度为1∶400及以上。布鲁氏菌病诊断流程图见图1。

图1布鲁氏菌病诊断流程图

2、细菌培养

布鲁氏菌病确诊需从血液、骨髓或其他组织和体液中培养出布鲁氏菌，细菌培养是布鲁氏菌病实验室检测金标准[6]。布鲁氏菌培养阳性率较低(10%～90%),影响培养结果的因素包括微生物(布鲁氏菌种类)、患者(年龄、症状持续时间、急性或慢性和局灶性疾病、首次感染或复发、标本种类、抗菌药物使用等)和培养方法(使用的培养设备、血培养次数、血标本量、培养时间和盲法传代培养效果等),培养结果为阴性时无法排除布鲁氏菌感染，还应结合临床表现、流行病学史及其他检测结果综合判断。

布鲁氏菌病的发病特点是在感染早期即存在菌血症，因此，怀疑布鲁氏菌病时应立即抽取血培养，由于感染初期血液中细菌浓度较低，应抽取2～3组不同的血培养[7]。随着布鲁氏菌病病程进展，布鲁氏菌进入吞噬细胞，血液中浓度降低，使布鲁氏菌培养较困难。由于布鲁氏菌生长缓慢、血菌浓度低和产二氧化碳的特点，需对自动化血培养系统中的常用程序进行修改，常规培养时间为5 d,但某些严重布鲁氏菌病病例需延长至7 d才能培养出布鲁氏菌。目前，已有多种培养方法被用于布鲁氏菌的检测，如Ruiz-Castaneda双相培养法(国外常用)、哥伦比亚血琼脂平板(国内常用)和新开发的自动化培养系统，新型培养工具还可对布鲁氏菌种类进行鉴定，提高了血培养的特异性[8]。25%～35%病例中，经最初的血液传播后，布鲁氏菌可进入远端组织器官进而发展为局灶性感染，因此，除血液外还可从其他部位标本中分离出布鲁氏菌，如骨髓、尿液、脑脊液、胸腔积液、胸膜、肝脏、淋巴结和脓肿组织等。

实验室获得性感染是布鲁氏菌传播的重要途径之一[9]。由于检测过程中可能产生感染血液的气溶胶，实验室工作人员在处理含布鲁氏菌的标本时感染风险较高，感染途径包括呼吸道、结膜上皮、胃肠道和被擦伤或暴露的皮肤。一项全国38家医院的多中心研究[10]发现，在667名实验室工作人员中有38例感染了布鲁氏菌病，实验室获得性感染发生率为5.7%。而在不发达地区，由于安全设备不足，实验室获得性感染风险更高。因此，在处理疑似布鲁氏菌的标本时，应在二级以上的生物安全柜内进行。

3、血清学检测

血清学检测是布鲁氏菌病的间接检测方法，主要是通过血清学方法检测患者血清中的特定抗体[11]。布鲁氏菌可诱导强烈的体液免疫反应，其主要特征是产生布鲁氏菌光滑型脂多糖抗体。人体在感染布鲁氏菌第1周血清IgM水平升高(可通过虎红平板凝集试验和试管凝集试验检测),第2周IgG1水平升高，第3周IgG2和IgA水平升高[12]。血清学检测主要分为针对布鲁氏菌光滑型脂多糖的检测和针对细胞质蛋白的检测。目前临床常用的血清学检测方法有虎红平板凝集试验、试管凝集试验、ELISA、补体结合试验、胶体金免疫层析试验、抗人球蛋白试验、荧光偏振免疫分析法等，而由于布鲁氏菌病的临床和流行病学特征(如年龄、病程、职业、病史、地域和暴露情况)及实验室差异，以上血清学方法结果的评判标准存在一些争议。

3.1针对光滑型脂多糖的检测方法

虎红平板凝集试验、试管凝集试验是主要针对光滑型脂多糖的检测技术，可作为牛种(Brucella abortus)、羊种(Brucella melitensis)、猪种(Brucella suis)布鲁氏菌的检测方法[13]。(1)虎红平板凝集试验较常用，但也有不足之处，如在流行区高背景抗体效价可影响其诊断价值，且由于与其他革兰阴性菌存在交叉反应，可出现假阳性结果，无法识别非凝集性免疫球蛋白(IgA/IgG),对布鲁氏菌慢性感染和有并发症的患者可能出现较高的假阴性率，阳性结果须由其他血清学试验确认。全球多数检测机构均建议虎红平板凝集试验应与其他方法(如培养和其他血清学)结合使用。(2)试管凝集试验可检测所有针对布鲁氏菌光滑型脂多糖的凝集性抗体(IgM、IgA和IgG),对产生症状的急性感染患者更敏感，但灵敏度随病程延长而降低，6个月后假阴性率高达20%,同时也存在与其他菌种抗体的交叉反应，可导致假阳性结果[14]。

3.2针对细胞质蛋白的检测方法

(1)ELISA:可用于布鲁氏菌中枢神经系统感染的检测(脑脊液),并用于鉴定不同动物宿主和人类的免疫球蛋白[15]。ELISA法检测人布鲁氏菌病的灵敏度(98.3%)和特异度(99.7%)高，检测迅速(4～6 h),还可针对性地检测不同抗体，包括非凝集性抗体[16]。但ELISA对实验室基础设施要求较高，不作为一般医疗机构的首选检测方法。(2)补体结合试验：是将布鲁氏菌补体结合抗原与待检血清中的抗体结合形成复合物，复合物再与补体结合，从而不引起指示系统中红细胞溶血的检测方法，该方法灵敏度和特异度高，是国际认可的血清学检测方法，多应用于牛、羊布鲁氏菌病的检测，但因补体结合试验的操作复杂性和标准化问题，不适合在小实验室进行。(3)胶体金免疫层析试验：是将胶体金标记技术、免疫检测技术和蛋白层析技术相结合，以硝酸纤维膜作为载体的固相膜免疫分析技术，该技术检测快速，结果易判读，适用于现场快速检测和初筛，但存在灵敏度低、质量难以控制、不易定量等不足。(4)量子点荧光免疫层析试纸条：可快速检测布鲁氏菌，使用简单方便，检测成本低，检测灵敏度为98.53%,特异度为93.57%,与标准凝集试验的总符合率高达97.3%,也可作为现场快速检测和初筛的方法[17]。

血清学检测的主要缺点是结果解释复杂(尤其是反复暴露于布鲁氏菌的患者)、无法区分活动性感染与既往感染。在布鲁氏菌病流行地区，假阳性结果可能是由于与检测未针对的病原体发生交叉反应或发现与先前暴露感染相关的免疫球蛋白，将对治疗决策造成不利影响。尽管血清学检测存在诸多不足，但其有检测成本低、操作简单和准确性高等优点，目前仍是布鲁氏菌病流行地区和不发达地区主要的检测方法[18]。

4、分子生物学方法

分子生物学方法即核酸扩增检测，数小时内即可检出布鲁氏菌，灵敏度和特异度较高[19]。但检测结果阳性不一定是活动性感染，也可能是隐性感染或既往感染(治愈后)。因此，应用核酸扩增检测诊断布鲁氏菌病时，还应结合患者临床症状和流行病学特征。血清是首选样本，量多且方便采集，也可使用其他样本进行检测，如来自骨关节、泌尿生殖系统、心血管系统和中枢神经系统的标本，有助于诊断布鲁氏菌病器官和组织局灶性感染。

核酸扩增检测的特异性靶标主要涉及编码外膜蛋白(outer membrane protein, omp)的基因，如omp2、omp31和omp28/bp26,omp免疫原性较强，可减少交叉反应引起的假阳性结果[20]。omp2是最先用于检测布鲁氏菌的基因，灵敏度(98%)和特异度(100%)高，阴性预测值为96.1%,在检测标本中少量布鲁氏菌方面较培养和血清学具有优势。由于某些基因在部分菌株中可能缺失(如omp31),不同基因在各个菌株中的诊断准确性存在差异。有研究[21]显示，在人和山羊血清中omp28/bp26的诊断准确率最高，分别为96.5%和95.9%,在牛血清中omp31的诊断准确率最高，为84.03%。以布鲁氏菌主要外膜蛋白的不同组合作为蛋白抗原(omp10、omp16、omp19、omp25、omp31和omp28/bp26),可提高诊断人、羊和牛布鲁氏菌病的准确性。其他基因靶标有16S rRNA(有交叉反应)、IS711(在某些菌株中缺失，其准确性受影响)、bcsp31(最常用的基因，编码免疫原性膜蛋白的合成)[22]。

核酸扩增检测的扩增方法包括传统PCR技术、in-house PCR、巢式PCR、PCR-酶免疫测定、实时荧光定量PCR、多重实时荧光定量PCR等。多重实时荧光定量PCR检测效率较高，检测样本中布鲁氏菌的准确性明显优于传统检测方法，还可鉴别布鲁氏菌种类和疫苗菌株(S 19,RB 51和Rev.1)[23]。

此外，近年也开发出一些新型检测方法，如环介导等温扩增、荧光原位杂交和二代测序等。(1)环介导等温扩增：无需电泳分析及昂贵的设备和试剂，仅需63℃恒温水箱，可在40 min内完成检测，不与其他病原菌发生交叉反应，是一种快速、简便、低成本的DNA检测方法。Shukla等[24]研究发现，环介导等温扩增检测布鲁氏菌的灵敏度达90.91%,特异度达99.37%,在临床样本中阳性率为20%,与传统PCR方法的一致性达89%,可作为医疗资源相对匮乏的布鲁氏菌病流行地区的现场筛查，可替代传统PCR技术评估布鲁氏菌病患病率，有助于早期诊断和治疗。(2)荧光原位杂交：针对16S rRNA,无需进一步传代培养和表型测试，从而加快诊断并降低实验室获得性感染的风险，是一种快速、经济的方法，适用于资源有限的实验室。(3)二代测序可检测样本中所有以DNA为遗传物质的微生物，而由于中枢神经系统感染并无特异性表现，二代测序在中枢神经系统感染的鉴别诊断中发挥重要作用[25]。Yu等[26]报道8例经二代测序诊断的神经型布鲁氏菌病，尽管患者病史、病程、临床表现、实验室检查和影像学检查结果各不相同，但均在4～8 d应用二代测序在脑脊液中检测到布鲁氏菌，经系统性治疗后，7例患者完全康复。二代测序检测的时效性和准确性较高，可用于诊断布鲁氏菌的局灶性感染(如脑脊液、关节液等),但检测技术要求较高且费用昂贵，仅适用于特定的临床情况。

5、不同检测方法在布鲁氏菌病患者随访中的应用

由于布鲁氏菌可在单核吞噬系统的细胞内存活甚至繁殖，因此，即使采用适当的抗菌药物治疗，布鲁氏菌感染也有较高的复发倾向，布鲁氏菌病复发率为4%～30%,主要取决于治疗药物疗效、持续时间、患者依从性和局灶性并发症等。随访布鲁氏菌病患者的主要目的在于评价治疗后机体病情变化从而及时调整治疗方案、预测远期疗效和复发风险。因此，需采用灵敏而准确的实验室诊断工具进行评估，但目前尚无公认的方法。马琳等[27]对50例布鲁氏菌病患者进行随访，采集样本进行细菌培养、试管凝集试验和PCR检测，结果显示12%的患者首诊时细菌培养阳性，随访期间内均为阴性；首诊及首诊后3、6、12个月时试管凝集试验阳性率分别为94%、14%、38%、40%,PCR阳性率分别为82%、80%、66%、64%;随访患者首诊及治疗3、6、12个月时临床症状与试管凝集试验一致率分别为86%、54%、58%、62%,与PCR一致率分别为74%、60%、46%、34%,不同实验室检测方法有不同特点，在患者随访方面PCR较传统方法更具优势。尽管PCR结果阳性不一定证明有活动性感染，但提示细胞有潜在感染的可能，未来需开展更长期随访进一步证实。

6、布鲁氏菌病的鉴别诊断

布鲁氏菌和人苍白杆菌及中间苍白杆菌是一类表型相似、遗传相关性密切的人类病原菌，引发疾病的临床症状相似，对该类细菌的鉴别相对困难。布鲁氏菌、人苍白杆菌及中间苍白杆菌经柯氏染色后均呈红色球杆状，基于培养和生化分析的商用细菌鉴定系统通常无法鉴别。有文献[28]报道，最初使用传统微生物学方法将1例免疫功能低下患者误诊为布鲁氏菌感染，应用16S rRNA基因测序正确鉴定出该患者为人苍白杆菌感染，证实了分子生物学方法在布鲁氏菌感染鉴别诊断中的重要应用价值。

7、结语

布鲁氏菌病是一种人畜共患病，可从受感染的动物传染给人类，人与人之间传染较罕见。尽管血清学和分子生物学方法已广泛应用于布鲁氏菌病的实验室诊断，但细菌培养仍是布鲁氏菌病诊断的金标准。由于各种检测方法均有其优缺点，多种检测方法联合使用对疑难病例或复杂病例的诊断有重要意义。临床实践中需根据情况选择合适的检测方法进行布鲁氏菌病的诊断。

利益冲突:所有作者声明无利益冲突。

参考文献:

[4]闫君杰,赵建民,刘瑞,等.布氏杆菌性脊柱炎诊断与治疗研究进展[J].中华实用诊断与治疗杂志,2019,33(6):615-618.

[25]秦灵芝,王晓娟,蒋玙姝,等.脑脊液宏基因组二代测序对结核性脑膜炎诊断价值[J].中华实用诊断与治疗杂志,2023,37(4):337-340.

[27]马琳.人布鲁杆菌病的随访调查和诊断方法研究[D].长春:吉林大学,2011.

基金资助:“天山英才”培养计划(2022TSYCLJ0024);

文章来源:宋云林,鲁晓擘.布鲁氏菌病实验室诊断方法研究进展[J].中华实用诊断与治疗杂志,2024,38(04):428-432.