柯萨奇病毒A组19型(coxsackievirus A19,CVA-19)属于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)C组肠道病毒(Enterovirus C,EV-C)。该病毒与脊髓灰质炎病毒(poliovirus, PV)同属于EV-C,但位于不同的进化分支，其与柯萨奇病毒A组1型(coxsackievirus A1,CVA-1)、柯萨奇病毒A组22型(coxsackievirus A22,CVA-22)、肠道病毒C组113型(enterovirus C113,EV-C113)和肠道病毒C组116型(enterovirus C116,EV-C116)在EV-C中形成独特的系统进化分支[1]。CVA-19的原型株NIH-8663(也称Dohi,于1952年在日本发现)可引起吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre syndrome, GBS),这是一种潜在的致命性感染疾病，是急性弛缓性麻痹(acute flaccid paralysis, AFP)的常见病因[2]。从呼吸道和胃肠道疾病[3,4]、无菌性脑膜炎[5]和AFP[6]患者的临床样本以及健康儿童粪便样本[7]和废水样本[8,9,10]中可检测到CVA-19。继Tao等[10]首次从山东省济南市污水中检出CVA-19后，2019年本课题组从河南省新乡市手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)患儿的粪便中检出CVA-19,完成了一株CVA-19(2019103106/XX/CHN/2019)的全基因组测序(GenBank登录号为MT175706)[11],并建立了CVA-19经口途径感染乳鼠模型以研究其发病机制[12]。进入21世纪以来，有关CVA-19的报道增多，且与多种疾病相关，因此有必要加强对该病毒相关疾病的监测，并及早布局研究相关防控措施。

疫苗是预防病毒性疾病最适用和最具成本效益的手段之一，可以显著降低病毒性疾病的死亡率和发病率，并延长人类预期寿命[13]。人肠道病毒(human enterovirus, HEV)RNA的高突变率和不同HEV毒株之间的重组导致其血清型众多。尽管PV和肠道病毒71型(enterovirus 71,EV-A71)的疫苗分别有效地预防了脊髓灰质炎和EV-A71相关HFMD,但尚不能为其他HEV引起的疾病提供交叉保护[14,15]。CVA-19作为一种不常见的、在我国新发现的HEV,目前尚未见其疫苗研究的报道。由于CVA-19难以采用常规细胞培养，只能接种乳鼠增殖[1],因此难以制备常规的灭活或者减毒疫苗。表位疫苗基于抗原表位制备疫苗，不受体外培养限制，为CVA-19疫苗研发指明了方向。

设计表位疫苗首先要确定可刺激机体产生有效免疫应答反应的抗原表位，即B细胞表位和T细胞表位，前者可分为线性(连续)和构象(不连续)表位，后者均为线性表位。目前尚未见CVA-19抗原表位的研究报道。HEV是一种小型、无包膜的单股正链RNA病毒，其基因组RNA由4种衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4组成的二十面体外壳所包裹[16],其VP1蛋白是决定病毒抗原性的主要成分，且能诱导机体产生中和抗体，因此，HEV抗原表位的研究主要集中于VP1蛋白[16,17]。本研究以CVA-19 VP1蛋白为研究对象，通过生物信息学方法，预测其理化性质、结构功能、线性B细胞表位和T细胞表位，以期为CVA-19 VP1蛋白线性表位的鉴定奠定基础，将有助于CVA-19表位疫苗和抗体药物的研发。

1、材料与方法

1材料

VP1基因序列(888个核苷酸)和VP1蛋白序列(296个氨基酸)源于本课题组前期测序并上传GenBank的CVA-19全基因组序列(GenBank登录号MT175706)[11]。VP1蛋白的氨基酸序列如下：GIDDI IDNVVTNALKVSMPQVQDTQSSGPVNSKEVPAL TAVETGATSQVDPSDLIETRHVINNRLRSECTIE SFFGRSACVAIIGLSNQKPTDDNAAKLFATWKIS YLDTYQLRRKLEFFTYSRFDLELTFVISERFFTST SAAARDYVYQIMYIPPGAPIPQAWDDYTWQSST NPSIFYTTGNACPRVSIPFVGIGAAYSHFYDGFSL VPFNTIDAGASNRYGYTTINDFGTMAIRIVNEYD PVTIDAKVRVYMKPKHIKVWCPRPPRAVAYNG PTVNFNENPHVMTAVADIRTY。

2方法

2.1 CVA-19 VP1蛋白的理化性质分析

利用ProtParam[18](https: //web.expasy.org/protparam)分析CVA-19 VP1蛋白的氨基酸组成、分子式、分子质量、等电点、不稳定系数和总平均亲水性，以及在哺乳动物网织红细胞、酵母和大肠埃希菌中的半衰期。利用ProtScale[18](https: //web.expasy.org/protscale/)中Kyte和Doolittle方法预测其疏水性。

2.2 CVA-19 VP1蛋白的结构功能分析

利用SignalP 6.0[19](https: //services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/)分析CVA-19 VP1蛋白的信号肽，设置参数：生物类型为“其他”,输出格式为“长输出”,模型模式为“慢速”;利用DeepTMHMM[20](https: //dtu.biolib.com/DeepTMHMM)预测CVA-19 VP1蛋白的跨膜结构域；利用NetPhos-3.1[21](https: //services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/)预测CVA-19 VP1蛋白的磷酸化位点，设置参数：预测的残基为“3种残基”,显示分数高于“0”,阈值为0.5,输出格式为“经典的”;Motif Scan(https: //myhits.sib.swiss/cgi-bin/motif_scan)预测CVA-19 VP1蛋白的脂酰化位点；分别利用NetCGlyc-1.0[22](https: //services.healthtech.dtu.dk/services/NetCGlyc-1.0/)、NetNGlyc-1.0[23](https: //services.healthtech.dtu.dk/services/NetNGlyc-1.0/)和NetOGlyc-4.0[24](https: //services.healthtech.dtu.dk/services/NetOGlyc-4.0/)预测CVA-19 VP1蛋白的C-甘露糖基化位点、N-糖基化位点和O-GalNAc(粘蛋白型)糖基化位点，阈值为0.5;利用SOPMA[25](https: //npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)预测CVA-19 VP1蛋白的二级结构，输出宽度为70,设置参数：“4种构象状态(螺旋、折叠、转角和无规则卷曲)”,相似度阈值为“8”,窗口宽度为“17”;用SWISS-MODEL[26](https: //swissmodel.expasy.org/)预测CVA-19 VP1蛋白的三级结构，选择与CVA-19 VP1蛋白序列相似性最高的模型作为同源建模的模板。

2.3 CVA-19 VP1蛋白的抗原表位参数预测

利用免疫表位数据库网站IEDB[27](https: //www.iedb.org/)分析CVA-19 VP1蛋白的亲水性(Parker法)、表面可及性(Enimi法)、可塑性(Karplus & Schulz法)、抗原性(Kolaskar & Tongaonkar法)和β-转角(Chou & Fasman法)。

2.4 CVA-19 VP1蛋白的线性B细胞表位预测

利用在线工具BepiPred 3.0[28](https: //services.healthtech.dtu.dk/services/BepiPred-3.0/)、ABCpred[29](https: //webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html)及SVMTrip[30](http: //sysbio.unl.edu/SVMTriP/prediction.php)预测CVA-19 VP1蛋白的线性B细胞表位，设置：BepiPred 3.0阈值为0.1512且去除小于5个氨基酸组成的肽段，ABCpred阈值为0.85,SVMTrip阈值为0.8;利用VaxiJen[31](http: //www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html)分析预测出的线性B细胞表位的抗原性，目标生物为“病毒”,阈值为0.4。

2.5 CVA-19 VP1蛋白的T细胞表位预测

应用IEDB和SYFPEITHI[32](http: //www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)综合预测CVA-19 VP1蛋白的T细胞表位：预测细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)表位时，选取HLA-A*02∶01等位基因，长度为“9 aa”;预测辅助性T细胞(helper T cell, Th)表位时，选取HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0301、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*1101和HLA-DRB1*1501人类HLA II等位基因进行预测，长度为“15 aa”。

2、结 果

1 CVA-19 VP1蛋白的理化性质

ProtParam工具分析CVA-19 VP1蛋白的理化性质，结果显示，CVA-19 VP1蛋白共由20种氨基酸组成，其中苏氨酸(8.8%)、丙氨酸(8.4%)和缬氨酸(8.1%)所占的比例居前三位；带负电荷残基总数(天冬氨酸和谷氨酸)为29,带正电荷残基总数(精氨酸和赖氨酸)为26;分子式为C1491H2274N392O445S9,分子质量为33.099 ku,等电点为5.84;当CVA-19 VP1蛋白的N端为甘氨酸时，在哺乳动物网织红细胞中的半衰期为30 h,在酵母体内>20 h,在大肠埃希菌内>10 h;不稳定系数为37.50(小于阈值40),属于稳定蛋白；脂肪族氨基酸系数为78.07,热稳定性较好。因此，CVA-19 VP1蛋白是一种热稳定性较好的蛋白质。

2 CVA-19 VP1蛋白的亲疏水性

ProtParam工具分析CVA-19 VP1蛋白总平均亲水性为-0.185,为亲水性蛋白。利用Protscale工具分析CVA-19 VP1蛋白的亲疏水性(图1),结果显示CVA-19 VP1蛋白氨基酸多肽链的第82位的丙氨酸Ala和第83位的异亮氨酸Ile分值最高，得分为2.433,说明这两个位点是CVA-19 VP1蛋白中疏水性最强的位点；第91位脯氨酸Pro分值最低，得分为-2.722,说明该位点为CVA-19 VP1蛋白中亲水性最强的位点；CVA-19 VP1蛋白氨基酸序列中亲水性区域分布均匀，且多于疏水性的区域，提示CVA-19 VP1蛋白为亲水性蛋白。因此，CVA-19 VP1蛋白是一种亲水性蛋白。

3 CVA-19 VP1蛋白的信号肽和跨膜结构域

应用在线软件SignalP 6.0对CVA-19 VP1蛋白进行信号肽预测，发现该蛋白无信号肽(图2),属于非分泌性蛋白。DeepTMHMM预测CVA-19 VP1蛋白的跨膜结构域，结果显示其整条肽链全部处于膜外，无跨膜区域存在(图3)。因此，CVA-19 VP1蛋白为无跨膜区域的非分泌性蛋白。

图1 CVA-19 VP1蛋白的亲疏水性分析 

图2 CVA-19 VP1蛋白的信号肽预测  

图3 CVA-19 VP1蛋白的跨膜结构域预测  

4 CVA-19 VP1蛋白的磷酸化位点和脂酰化位点

用NetPhos-3.1预测CVA-19 VP1蛋白的磷酸化位点，结果显示CVA-19 VP1蛋白有30个可能的磷酸化位点(图4):10个位于丝氨酸残基，15个位于苏氨酸残基，5个位于酪氨酸残基。用Motif Scan预测发现CVA-19 VP1蛋白没有可能的脂酰化位点。这表明该蛋白可能有较多的磷酸化位点，但可能无脂酰化位点。

图4 CVA-19 VP1蛋白的磷酸化位点预测  

5 CVA-19 VP1蛋白的糖基化位点

利用NetCGlyc-1.0分析发现CVA-19 VP1蛋白没有C-甘露糖基化位点；利用NetNGlyc-1.0分析发现CVA-19 VP1蛋白有1个潜在的N-糖基化位点，位于第175位的天冬酰胺Asn;利用NetOGlyc-4.0预测发现CVA-19 VP1蛋白有7个潜在的O-GalNAc(粘蛋白型)糖基化位点，分别位于第17、24、27、32、39、47和277位氨基酸残基。因此，CVA-19 VP1蛋白可能具有较多的O-GalNAc(粘蛋白型)糖基化位点。

6 CVA-19 VP1蛋白的二级结构

应用SOPMA在线工具对CVA-19 VP1蛋白二级结构进行分析，结果显示该蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占24.66%、24.32%、2.70%和48.31%(图5)。因此，CVA-19 VP1蛋白的二级结构以无规则卷曲为主。

图5 CVA-19 VP1蛋白二级结构预测  

7 CVA-19 VP1蛋白的三级结构

采用在线工具SWISS-MODEL预测CVA-19 VP1蛋白的三级结构并进行同源建模，结果显示序列相似性最高(64.41%)的模板为4q4v.1.A柯萨奇病毒衣壳蛋白/VP1柯萨奇病毒A组24型v晶体结构，以此模板进行同源建模，获得CVA-19 VP1蛋白的三维结构模型(图6)。该模型GMQE为0.72,QMEANDisCo Global为0.68±0.05,表明质量良好。

8 CVA-19 VP1蛋白的线性B细胞表位

在线预测网站IEDB分析，得到CVA-19 VP1蛋白的亲水性、表面可及性、可塑性、抗原性和β-转角等抗原表位参数(图7)。应用Bepipred 3.0预测其线性B细胞表位，共预测到6条得分大于阈值0.1512,且长度大于5个氨基酸的可能的线性B细胞表位(表1)。运用ABCpred预测VP1蛋白的线性B细胞表位，阈值为0.85时，共预测到11条可能的线性B细胞表位(表2)。利用SVMTrip预测线性B细胞表位，获得得分大于阈值0.8的6种长度(10、12、14、16、18和20个氨基酸)的线性B细胞表位13条(表3)。利用VaxiJen分析了上述方法获得的线性B细胞表位肽的抗原性(表1～3)。

图6 CVA-19 VP1蛋白的三级结构预测

表1 BepiPred 3.0预测CVA-19 VP1蛋白的线性B细胞表位

表2 ABCpred预测CVA-19 VP1蛋白的线性B细胞表位

表3 SVMTriP预测CVA-19 VP1蛋白的线性B细胞表位

图7 CVA-19 VP1蛋白的表位参数预测  

综合Bepipred 3.0、ABCpred、SVMTriP预测和IEDB分析，选取CVA-19 VP1蛋白亲水性高、柔韧性好、表面可及性大和抗原性强的区域，同时参考其二级结构的预测结果，选取包含无规则卷曲和/或β-转角的区域，最终筛选出6个潜在的优势线性B细胞表位，分别位于CVA-19 VP1蛋白氨基酸区段：19-33、35-54、126-139、206-221、212-227和250-265(表4)。

9 CVA-19 VP1蛋白的T细胞表位

应用IEDB和SYFPEITHI综合预测CVA-19 VP1蛋白T细胞表位，综合选择IEDB得分≥0.5且SYFPEITHI得分≥20的预测结果，共预测到3个潜在的优势CTL表位(表5)和9个潜在的优势Th表位(表6)。

表4 CVA-19 VP1蛋白潜在的优势线性B细胞表位

表5 CVA-19 VP1蛋白潜在的优势CTL表位

表6 CVA-19 VP1蛋白潜在的优势Th表位

3、讨 论

目前，全球根除脊髓灰质炎行动取得了空前的成就，2型和3型野生PV已被成功根除，仅有1型野生PV在阿富汗和巴基斯坦传播[33]。然而，包括EV-A71、肠道病毒D组68型(enterovirus D68,EV-D68)等在内的一些非PV的HEV感染已成为全球重要的公共卫生问题[34,35,36]。这些病毒感染可引起诸如腹泻、HFMD、疱疹性咽峡炎等轻症，亦可造成心肌炎、急性迟缓性麻痹、神经性肺水肿、脑炎、脑膜炎等严重疾病，甚至死亡。近年来，CVA-19已被报道与胃肠炎[4]、无菌性脑膜炎[5]、AFP[6]等相关，并在其他临床样本[3]、健康儿童粪便[7]和污水样本[8,9,10]中检出。本课题组前期从HFMD患儿中检出CVA-19[11],并发现CVA-19可致小鼠腹泻和脑脊髓炎[12]。鉴于CVA-19与PV同属于EV-C但位于不同进化分支[1],也能引起无菌性脑膜炎和AFP等神经系统并发症，有必要研发针对CVA-19的防治措施。由于CVA-19难以用常规细胞进行培养，其灭活疫苗和减毒疫苗的研发受阻，而不受细胞培养限制的表位疫苗则颇有前景，但这有赖于明确CVA-19的抗原表位。基于计算机辅助的生物信息学方法已成为很多表位预测的首选方法。与传统实验方法相比，生物信息学方法分析蛋白的结构功能和预测表位更加高效、准确[37]。VP1蛋白是HEV表面主要的可及性蛋白，含有重要的血清型特异性中和表位，是决定病毒抗原性的主要区域，可以诱导中和抗体的产生[17]。因此，本研究利用生物信息学方法分析了CVA-19 VP1蛋白的理化性质、结构功能并预测出其潜在的优势线性B细胞表位和T细胞表位，以期为其线性表位的鉴定奠定基础，有助于其表位疫苗和抗体药物的研发。

本研究发现CVA-19 VP1蛋白亲水性区域多于疏水性的区域，属于亲水性蛋白；不稳定系数较低，属于稳定蛋白。脂肪族氨基酸不但具有较好的溶解性和稳定性，还可以提高蛋白质的抗氧化能力。CVA-19 VP1蛋白的脂肪族氨基酸系数较高，表明其热稳定性和抗氧化性较好，有利于其运输和储存[38]。

磷酸化和糖基化是保证蛋白质正常生物学活性和功能的重要的翻译后修饰[39]。磷酸化在蛋白质的相互作用、蛋白质稳定性、信号转导、转录调节、细胞内定位、分化发育和凋亡等方面起着至关重要的作用[40]。本研究发现CVA-19 VP1蛋白存在30个可能的磷酸化位点，说明在病毒感染过程中VP1蛋白很可能起重要的调控作用。糖基化在病毒感染进程、致病性和免疫逃逸中起着至关重要的作用[41]。尽管本研究预测出CVA-19 VP1蛋白有7个可能的O-GalNAc(粘蛋白型)糖基化位点和1个可能的N-糖基化位点，但由于预测该蛋白无信号肽，故其在体内可能不会被糖基化[42]。

蛋白质的二级结构影响着其抗原表位的形成：无规则卷曲多处于蛋白质的表面，结构松散，有利于与抗体嵌合，成为抗原表位的可能性大；α-螺旋的化学键键能比较高，形态稳定，是蛋白的刚性支撑，能更好地稳固蛋白质的高级结构[43]。对CVA-19 VP1蛋白的二级结构进行预测，发现无规则卷曲在该蛋白中占比最高，其次是α-螺旋，说明该蛋白易于形成抗原表位且结构较稳定，这与VP1蛋白为HEV最具抗原性的蛋白之一及该蛋白为稳定蛋白相符。

B细胞通过产生抗体发挥独特的作用，这些抗体可以在病毒进入细胞之前中和及清除病毒颗粒，在高度保护性的抗病毒免疫中做出关键贡献[44]。因此，本研究通过Bepipred 3.0、ABCpred和SVMTriP三种方法预测出CVA-19 VP1蛋白的线性B细胞表位，结合亲水性、表面可及性、可塑性和抗原性等抗原表位参数及二级结构等信息，采用投票法全面整合预测结果[45],筛选出其6个潜在优势线性B细胞表位。利用保护性抗原和亚单位疫苗抗原性预测工具--VexiJen分析潜在线性B细胞表位肽的抗原性，能够排除抗原可能性低的表位肽。多种抗原表位预测方法的联合应用不仅避免了单方法分析预测结果准确性低的问题，还增加了获得正确抗原表位的概率。预测出的CVA-19 VP1蛋白潜在优势线性B细胞表位212-227(FNTIDAGASNRYGYTT)与已经实验验证的柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CV-A16)VP1蛋白的线性B细胞表位PEP71(211-225:FGEHLQANDLDYGQC)[46]部分重叠；潜在优势线性B细胞表位35-54(VPALTAVETGATSQVDPSDL)与实验验证的EV-71 VP1蛋白的线性B细胞表位43-54(KVPALQAAEIGA)[47]部分重叠；潜在优势线性B细胞表位35-54(VPALTAVETGATSQVDPSDL)与多克隆抗体5D8/1在1型脊髓灰质炎病毒(poliovirus 1,PV1)识别的保守表位40-48(EIPALTAVE)[48]部分重叠，该抗体能与A、B和C组多种肠道病毒VP1蛋白交叉反应。因此，本研究预测的线性B细胞表位结果可信度较高。

在病毒感染过程中，CTL细胞可直接杀死感染病毒的细胞，Th细胞能够调节抗病毒免疫，从而发挥抗病毒作用[49]。本研究通过应用IEDB和SYFPEITHI综合预测筛选出CVA-19 VP1蛋白的3个潜在优势CTL表位和9个潜在优势Th表位。本研究预测出的CVA-19 VP1蛋白T细胞表位与PV1的T细胞表位有多处重叠[50]:CTL表位254-262(YMKPKHIKV)与PV1的T细胞表位260-268(YLKPKHIRV)有77.8%的序列相似性；CTL表位1-9(GIDDIIDNV)与PV1的T细胞表位1-9(GLGQMLESM)均处于VP1蛋白N-最末端；Th表位206-220(GFSLVPFNTIDA GAS)与PV1的T细胞表位214-224(KVPLKDQS AAL)部分重叠，并且位于CVA-19 VP1蛋白潜在优势线性B细胞表位206-221(GFSLVPFNTIDAGA SN)区段内。这表明区段206-220(GFSLVPFNTID AGAS)可能既是线性B细胞表位又是Th细胞表位，可以同时诱导体液免疫和细胞免疫，这对于CVA-19表位疫苗设计非常重要。本研究预测出CVA-19 VP1蛋白具有较多的潜在优势线性B细胞表位和优势T细胞表位，表明其作为疫苗免疫原具有潜在的优势。

HEV VP1蛋白的N-端是一个优势抗原区[51]。Zhang等[52]发现EV-A71 VP1蛋白的主要免疫反应区位于N-端残基6-43,而且N-端残基1-5为CV-A16和埃可病毒6(echovirus 6,E-6)的共同表位；Gao等[47]鉴定出EV-A71 VP1蛋白的一个线性B细胞表位位于N-端残基43-54;Zhang等[53]发现VP1蛋白N-端残基36-55是EV-A71、CV-A16、柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus A10,CV-A10)和柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus A6,CV-A6)的共同表位。本研究预测出CVA-19 VP1蛋白的N-端残基19-33和35-54为其潜在优势线性B细胞表位，且N-端残基1-9和13-21为其潜在优势CTL表位，这不但表明CVA-19 VP1蛋白N-端含有数个潜在的优势表位，且与上述研究结果相符。因此，本研究对于CVA-19 VP1蛋白N-端线性表位的预测结果较为可靠。

综上所述，本研究结合多种生物信息学软件和在线工具，分析了CVA-19 VP1蛋白的理化性质和结构功能，并预测出其6个潜在优势线性B细胞表位、3个潜在优势CTL表位和9个潜在优势Th细胞表位。结果将为进一步研究CVA-19 VP1蛋白的结构功能奠定基础，后续将通过实验验证体外合成预测的抗原表位，以鉴定出CVA-19 VP1蛋白的线性表位，为CVA-19表位疫苗的研发和抗体药物的制备提供科学依据。

基金资助:河南省科技攻关项目(No.222102310641);

文章来源:杨亚文,冯琳琳,陶玲等.柯萨奇病毒A组19型VP1蛋白生物信息学分析[J].中国病原生物学杂志,2024,19(03):249-256+262.