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人细小病毒B19实验室诊断技术研究进展

2024-04-15 5 上传者：管理员

摘要：人细小病毒B19(B19V)是细小病毒科的一种小的非包膜单链DNA，在人群中普遍存在。B19病毒能够通过呼吸道、血液、胎盘等进行传播，进而引起儿童传染性红斑、再生障碍危象、胎儿积水和宫内胎儿死亡等疾病。本文主要从B19病毒的基因分型、蛋白表达、感染机制及实验室检测技术等方面来综述B19病毒的性质和诊断情况，以期提供更多关于其生物学特性的信息，这可能有助于研究人员对检测方法的应用及发展有更深层次的了解。

关键词：
人细小病毒B19
分子检测
基因分型
检测技术
蛋白结构
血清学检测
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人细小病毒B19(human parvovirus B19,B19V）是一种属于细小病毒科红病毒属的小型无包膜单链线状DNA(ss DNA）病毒。该病毒于1975年在筛查乙肝病毒时被发现，并于1981年首次与人类疾病联系起来，1985年被正式命名为B19V[1]。

B19V作为一种重要的呼吸道病原体，在人群中普遍存在，没有种族、社会经济或地理界限，可通过呼吸道、血液、胎盘等进行传播。其感染后的主要临床表现为低烧、面部皮疹，随后向躯干和四肢扩散黄斑丘疹[2]。与B19V感染有关的疾病（如传染性红斑、再障危象等）主要集中于儿童、免疫功能缺陷或者不全的患者以及贫血患者。此外，B19V感染还能够引起胎儿水肿甚至死胎、肾小球病和终末期肾病贫血、关节病等相关疾病。但到目前为止，尚有许多疾病（如白血病、心肌炎等）与B19V感染的关系尚不明确[3]。

1、基因组成和蛋白表达

1.1基因结构与分型

B19V粒子为T=1的正二十面体结构，无包膜，直径为20～26 nm。B19V基因组简单，全长5596 nt，其两侧末端各具有完全相同的末端重复序列，形成发夹结构。该序列具有基因组复制中形成的双链DNA的复制起始位点，是病毒基因组复制的关键。B19V中间的编码区主要由左右两侧的非结构蛋白（NS1）和衣壳蛋白（VP1/2）基因组成[4]。

B19V可分为3种基因型（1型、2型和3型）[5]，其中基因1型是目前全球大部分地区普遍流行的基因型[6]，包含绝大部分发现的B19V株，如Au、J35；基因2型主要代表病毒株为La Li、A6等；基因3型主要代表病毒株为D91.1和V9。后来进一步的系统进化树分析又将1型分为1a和1b型；3型分为3a(V9）和3b(D91.1)[7]。不同基因型在核苷酸序列上存在明显的差别，大部分的差别都在第3个核苷酸位置，但其突变并不影响氨基酸的正常编码，不同基因型病毒蛋白同源性在96%～97%之间，因此3种基因型具有相似的生物学、病原学和抗原学特性[8]。

1.2转录及蛋白表达

B19病毒的前体m RNA由单一的P6启动子转录，并通过选择性剪切和多腺苷酸化形成12个病毒m RNA转录物，其中NS1(78 k D）是由未经剪接的m RNA转录子翻译而来，其余11个经过剪接的m RNA转录编码VP1(84 k D）、VP2(58 k D）、非结构蛋白11 k D和7.5 k D[9]。其中NS1蛋白在基因1型、基因2型和基因3型之间的差异约为6%[10]，而基因3型变异的NS1蛋白差异较为多样[11]。VP1蛋白和VP2蛋白组成了病毒衣壳，包裹在B19V DNA表面，其线性表位能够结合抗体，构成B19V的抗原性[12]。VP2为主要蛋白，占95%，其对于B19V样颗粒（VLPs）的形成是必需的；VP1为次要蛋白，只占95%，在其氨基末端比VP2多226个氨基酸，称为VP1独特区域（即VP1u区）。非结构蛋白11 k D对于维持B19V的感染性有重要作用[13]，而7.5 k D的功能目前仍不明确。

2、致病机制及免疫反应

2.1感染致病机制

红细胞糖苷脂（globotetraosylceramide,Gb4），又称P抗原，是B19的细胞受体，位于红系祖细胞膜上，可与VP2蛋白结合并促进其内化[14]。B19V通过与红细胞P抗原结合而感染红细胞，使其发生裂解或凋亡，导致前体红细胞进行性减少和暂时性的红细胞生成停止，严重的可导致再生障碍危象。

2.2感染后机体的免疫反应

不同人群感染B19V后产生不同强度的免疫应答，抗体是对B19V感染的适应性免疫反应的标志。B19V感染1周后出现病毒血症，通常持续5 d。B19V感染的后期阶段（病毒感染的10～12 d），特异性Ig M抗体产生，通常可持续约5个月或者更久。在B19V感染后约15 d，开始产生特异性Ig G抗体[15]，针对结构蛋白VP1和VP2构象性表位的Ig G抗体可持久维持高滴度，并有可能长期存在体内[12]。

3、实验室检测技术

B19V感染的检测方法主要包含血清学和分子生物学方法，各种检测方法均有优缺点。B19V血清学检测的方法主要有免疫荧光法（immunofluorescence assay,IFA）、酶联免疫法（enzyme immunoassay,EIA）和化学发光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay,CLIA）等。相关研究表明，将B19V抗原和Ig M抗体酶联免疫法结合使用，能检测出测试人群中91%的B19V急性感染者[16]。虽然各种检测技术一直在改进和发展，但B19V抗原检测试剂灵敏性和特异性均偏低，目前的应用仍较少。B19V Ig M和Ig G抗体检测是目前B19V感染临床辅助诊断和流行病学调查研究的主要方法，用于对传染性红斑患者、有B19V感染者接触史、不明原因发热、关节痛症状的高危对象进行检测。核酸检测B19V DNA灵敏度高，不受检测时间限制，但由于基因易突变且不同基因型间的序列差异会影响B19V感染的分子诊断，并且感染数年后依旧能检测到B19V DNA的存在。原位杂交技术检测病毒核酸和免疫组化检测病毒蛋白，可以作为补充B19V感染的诊断。因此，临床实际应用时需选择合适的检测手段，必要时可两种或多种方法联合使用[17]。

3.1抗原检测

由于具有很强的嗜红系祖细胞的特性，B19V起初很难在体外培养。随着重组抗原技术的应用，B19V抗原可通过细胞培养获得。原核表达系统产生的B19V重组VP1和VP2蛋白，由于操作过程中易变性，作为靶抗原进行抗体检测时会出现假阴性结果[18]。而真核表达系统可以表达出与天然病毒具有一致抗原性且有构象性表位的病毒空衣壳。因此，目前多应用真核生物表达系统（例如杆状病毒表达系统）表达出的衣壳蛋白进行特异性抗体检测，得到的结果准确，对于检测B19V感染有重要意义[19]。

3.2抗体检测

B19V Ig M/Ig G抗体检测是指基于抗原抗体反应原理，采用免疫层析法、酶联免疫法和化学发光法等检测技术，对来源于血清或血浆等人体样本中的B19V Ig M/Ig G抗体进行体外定性检测的试剂[19]。Ig M抗体和Ig G抗体都是针对VP1和VP2蛋白的，Ig M一般在感染10 d左右可以测出，对B19V特异Ig M进行检测可用于近期感染和疾病的早期诊断[20]。Ig G抗体在Ig M刚出现的短期内（约5 d）即可检测到，Ig G抗体可维持高滴度数月，并长期存在体内，可用于既往感染的诊断[21]。目前采用B19V衣壳蛋白VP2组装成病毒样颗粒（VLPs），与天然病毒的抗原结构非常相似，检测Ig M和Ig G抗体是最可靠的，是公认免疫检测的标准抗原[2]。但也有报道针对NS1蛋白进行Ig M和Ig G抗体的检测，可以作为以衣壳蛋白为诊断抗原的补充，对诊断B19V的急性感染也有一定意义[18]。

3.3核酸检测

B19V DNA感染早期即可在血清中被发现，低水平B19V DNA感染后数月到数年都可被PCR检测到。B19V核酸检测主要包括核酸分子杂交技术和核酸扩增技术。核酸分子杂交技术包括斑点杂交法、原位杂交法等。斑点杂交法由于灵敏度低而逐渐被淘汰，原位杂交法则常被用来检测细胞内和组织内的B19V DNA[3]。核酸扩增技术（NAT）主要包括普通PCR、巢式PCR和荧光定量PCR。荧光定量PCR是目前最常用的B19V核酸检测方法[22,23]，其敏感性和特异性均很高，常用于病毒分型检测以及血液中B19V的大规模筛查。

4、总结与展望

虽然B19V感染是一种自限性疾病，但其还可以通过血液制品进行传播，对免疫力较低的患者具有潜在的致病威胁。在输血给受试者前，应仔细筛选血液和血液产品中B19V的情况。目前美国食品药品监督管理局已规定对血浆库进行B19V DNA检测，对于B19V DNA浓度超过104拷贝/ml的血浆库将废弃不予使用。国内外普遍采用原料血浆病原体筛查、原料血浆检疫期管理和血浆蛋白分离过程中增加病毒灭活/去除工艺等不同手段，进行病毒安全性控制，以最大限度降低血液制品病原体污染的风险。因此，更精准地对血液制品中是否存在B19V的感染进行检测也是非常关键的[24]。

B19V的血清学检测是B19V诊断的基础，而病毒核酸检测则能提供进一步的协助诊断。对于B19V抗原检测来说，从B19V粒子到体外纯化的重组衣壳蛋白VP1/VP2以及VLPs皆可作为抗原的检测，其中VP1和VP2是最常用的抗原[12]。目前，商业化Ig M和Ig G抗体检测试剂盒主要采用的是酶联免疫法和胶体金法。截至2023年8月1日，已获得国家药品监督管理局NMPA批准上市的B19Ig M抗体检测试剂盒共有8款（其中有一款试剂盒是多联检），B19 Ig G抗体检测试剂盒有4款，主要用于定性检测人血清样本中的人细小病毒B19 Ig M和Ig G抗体。

虽然国内还未有B19V核酸检测的商业化试剂盒批准上市，但国际上已有商用试剂盒（Qiagen公司artus®Parvo B19 LC PCR Kit和Roche公司cobas®Taq Screen DPX Test）上市[19]。Roche公司的试剂盒虽然灵敏度高，但不能检测出基因2型病毒，而Qiagen公司的试剂盒可检测出基因2型和基因3型中的质粒D91.1[25]。世界卫生组织（WHO）已建立了第三代人细小病毒B19核酸国际标准品和第一代人细小病毒B19核酸分型国际参考品（NIBSC编号分别为12/208和09/110）。虽然我国还没有B19V核酸诊断试剂的行业标准、审评指导原则和标准物质，也没有已上市的B19V核酸检测试剂，但中国食品药品检定研究院已经研制了人细小病毒B19核酸检测试剂国家参考品（编号为370005-201601）以及人细小病毒B19核酸检测试剂国家标准品（编号为370023-201601），用于对国内此类产品进行系统的质量评价并建立统一的质量标准[24]。国内很多企业也已经在积极研发B19V核酸检测试剂，相信在不久的将来会有商业化的检测试剂盒陆续应用于临床，更精准地辅助临床医生对B19V感染的诊断和血液制品B19V污染的质量控制。

参考文献:

[4]赵林清,钱渊,吴金屏,等.血清与骨髓中细小病毒B19的检测及相关疾病探讨.中国小儿血液, 2004, 9(5):217-220.

[7]董衍明,李京京,徐鹏,等.人细小病毒B19分子生物学研究进展.生物工程学报, 2020, 36(5):879-890.

[18]贾俊婷,马玉媛,向思龙,等.人细小病毒B19检测技术.临床输血与检验, 2015, 17(5):472-477.

[19]国家药品监督管理局.人细小病毒B19 IgM/IgG抗体检测试剂注册技术审查指导原则. 2021-04-07.

[24]麻婷婷,许四宏,周海卫.人细小病毒B19核酸检测试剂国家参考品的建立.分子诊断与治疗杂志, 2020, 12(12):1596-1599, 1603.

[25]王敏,侯继锋.血液制品中人细小病毒污染及其灭活进展//中国药学会. 2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集.天津:2010:8470-8474.

文章来源:任珊珊,赵兰青,许四宏.人细小病毒B19实验室诊断技术研究进展[J].中国医药生物技术,2024,19(02):161-164.