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基孔肯雅病毒(CHIKV)重组痘苗病毒候选疫苗小鼠免疫研究

2024-04-12 99 上传者：管理员

摘要：目的基孔肯雅病毒(Chikungunya virus, CHIKV)是甲病毒属的正股RNA病毒，主要由埃及伊蚊和白纹伊蚊传播，广泛流行于亚洲和非洲的部分地区，每年给全球造成严重的经济损失。本研究基于重组痘苗表达系统构建了CHIKV重组痘苗候选疫苗，进行小鼠免疫评价，为CHIKV疫苗的研发提供理论基础。方法将CHIKV重组痘苗候选疫苗进行小鼠免疫评价，在首次免疫35 d后，收集血清用于特异性抗体检测以及细胞因子检测，分离小鼠脾脏淋巴细胞用于T细胞亚类分型分析，并在35 d时进行攻毒保护实验。结果免疫CHIKV重组痘苗候选疫苗小鼠特异性抗体显著升高，且细胞因子IL-4(P<0.05)和IFN-γ(P<0.05)的表达量显著高于对照组。CD3+CD4+T(P<0.05)和CD3+CD8+T(P<0.05)细胞比例显著高于对照组。攻毒保护实验结果显示，免疫疫苗组体重高于对照组。结论本研究中的CHIKV重组痘苗病毒候选疫苗可以诱导机体产生良好的细胞免疫和体液免疫应答反应，本研究结果可为CHIKV疫苗的研发提供参考。

关键词：
体液免疫
基孔肯雅病毒
披膜病毒
细胞免疫
重组痘苗病毒
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基孔肯雅病毒（Chikungunya virus,CHIKV），属于披膜病毒科甲病毒属，病毒直径约60～70nm，基因组为单股正链RNA。CHIKV感染可能有不同的临床表现，基孔肯雅病毒感染的急性期伴有各种症状，表现为高热、多关节炎和斑丘疹。慢性期表现为关节炎，并出现风湿症状[1]。大多数情况下，CHIKV的潜伏期通常为2～7d[2]。基孔肯雅病（Chikungunya virus,CHIK）的病原体于1952-1953年首次在东非（坦桑尼亚马孔德高原）的一次流行病中被分离出来[3,4]。1960年至1990年间，CHIK在非洲和亚洲零星爆发，2000年后再次频繁出现并蔓延至其他国家[5]。2014年，CHIKV在巴西引发了大规模流行，主要影响东北部地区[6]。2015年美洲报告了约693 489例疑似病例和37 480例确诊病例[7,8]。现有报道指出2022年1月至11月23日，共报告了362 021例病例和77例死亡病例，其中大多数病例报告发生在巴西（247 537例）[5]。CHIKV的感染每年给全球公共卫生安全带来了巨大的经济损失，但目前仍然没有商品化的疫苗用于预防CHIKV感染。因此，针对CHIKV的防治应该引起广泛关注。

痘苗病毒（Vaccinia virus,VACV）属于痘病毒科（Poxviridae）双链DNA病毒。本研究中的天坛株痘苗病毒是一个很有潜力的病毒，可以表达重组抗原或者作为病毒疫苗载体，目前已广泛用于新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)[9]、猪繁殖和呼吸障碍综合症（Porcine Reproductive and Respiratory Syndromevirus,PRRSV)[10]、猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type2,PCV2)[11]等候选疫苗的研究。

本研究将表达CHIKV的E1基因的重组痘苗病毒候选疫苗进行小鼠免疫评价，分别通过细胞免疫指标、体液免疫指标、以及攻毒保护等检测评价CHIKV重组痘苗病毒候选疫苗的免疫效果。本研究的结果将为CHIKV的疫苗研发工作提供理论基础。

1、材料与方法

1材料

1.1病毒和细胞来源

基孔肯亚重组痘苗病毒由本实验室构建保存；基孔肯亚病毒由本实验室构保存；BHK细胞，系叙利亚幼地鼠肾细胞，购自北纳生物。

1.2主要试剂DMEM培养基及胎牛血清

购于美国Hyclone公司；白细胞介素2(Interleukin-2,IL-2)、白细胞介素4(Interleukin-4,IL-4)和γ-干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)等ELISA检测试剂盒购自于上海科顺生物有限公司；CD3、CD4、CD8等流式细胞抗体购自于美国Biolegend公司；TMB显色液及显色终止液购自于碧云天生物有限公司。

2方法

2.1 CHIKV重组痘苗病毒

鉴定将BHK细胞均匀的铺到12孔板中，培养8-12 h后加入CHIKV重组痘苗病毒在培养24 h。培养结束后收集细胞，分别进行荧光显微镜观察，蛋白质免疫印迹(Western blot, WB),以及聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)检测。

WB检测方法如下，收集细胞进行蛋白样品制备，以12%的SDS-PAGE分离胶进行实验，跑胶结束后，将分离胶蛋白转移至0.45μm的NC膜，加入封闭液室温封闭20～30 min。封闭后加入1∶500倍稀释的CHIKV-E1蛋白一抗4℃条件下孵育过夜，再使用1∶5 000倍稀释的HRP标记的二抗室温孵育40 min进行曝光显影。

PCR检测方法如下，收集细胞提取总DNA后作为PCR模板，以CHIKV的E1基因作为引物设计PCR体系：模板DNA2μL,上游引物(10μmol/L)0.5μL,下游引物(10μmol/L)0.5μL,2×PCR MasterMix10μL,ddH2O 7μL,总量20μL。

检测引物：CHIKV-E1-F:5′-ATGTACGAACAC GTAACAG-3′;CHIKV-E1-R:5′-TTAGTGCCTACT GAACGAC-3′。PCR扩增条件为：95℃预变性5 min; 95℃变性30 s, 60℃退火45 s, 72℃延伸2 min, 35个循环；72℃延伸10 min。

2.2小鼠免疫计划

将BALB/c小鼠随机分为3组(每组8只),分别设置CHIKV重组痘苗病毒免疫组(rVACV-E1-EGFP,107 TCID50/mL,100μL),痘苗病毒对照组(rVACV-EGFP,107 TCID50/mL,100μL),以及PBS免疫组(PBS,100μL)。各实验组通过肌肉注射进行免疫，首次免疫后14 d进行加强免疫，首次免疫后35 d,各实验组进行攻毒保护实验。

2.3特异性抗体检测

小鼠免疫后，每周尾静脉取血分离血清。将CHIKV的E1蛋白加入到ELISA检测板中4℃孵育过夜。PBST清洗3次后，加入5%脱脂乳37℃避光封闭2 h,封闭结束后PBST清洗3次后。将每周分离获得的小鼠血清1∶32倍稀释后加入到ELISA板中孵育2 h,用PBST清洗三次。加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗室温避光孵育1.5 h后，加入TMB显色液室温孵育15 min。孵育结束后，加入TMB终止液，并于450 nm处读取吸光度A值。

2.4细胞因子检测

小鼠首次免疫后35 d,尾静脉采血分离小鼠血清。按照IL-2、IL-4、以及IFN-γ等ELISA检测试剂说明书要求进行检测分析小鼠血清中细胞因子的含量。

2.5 T细胞亚类分析

小鼠首次免疫后35 d,安乐处死小鼠后，通过小鼠脾脏淋巴细胞分离试剂盒分离获得小鼠淋巴细胞。将获得的小鼠脾脏淋巴细胞浓度调整为106 cells/样，再加入CD3、CD4、CD8流式抗体置于4℃条件下避光孵育40 min。孵育结束后，利用含有5%胎牛血清的PBS清洗3次，上机检测分析CD3+CD4+T和CD3+CD8+T细胞的比例。

2、结果

1 CHIKV重组痘苗病毒鉴定

将BHK细胞感染CHIKV重组痘苗病毒48 h后，荧光显微镜观察结果显示，CHIKV重组痘苗病毒可以感染BHK细胞进行增殖，感染的BHK细胞显示增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP)的绿色荧光(图1A)。WB检测结果显示，感染CHIKV重组痘苗病毒组的细胞成功表达CHIKV的E1蛋白(图1B)。PCR鉴定结果显示，成功获得大小为1 323 bp的E1基因目的条带(图1C)。

图1 CHIKV重组痘苗病毒鉴定结果

2 CHIKV重组痘苗病毒免疫小鼠血清特异性抗体检测

特异性抗体检测结果显示，CHIKV重组痘苗病毒免疫后，特异性抗体持续升高。首次免疫7 d后，CHIKV重组痘苗病毒免疫组特异性抗体显著高于PBS组(P<0.05)。免疫后14 d起，CHIKV重组痘苗病毒组的特异性抗体显著高于重组痘苗病毒组(P<0.01)和PBS组(P<0.01)(图2)。

3 CHIKV重组痘苗病毒免疫小鼠血清细胞因子分析

各实验组首次免疫35 d时，随机选取3只小鼠分离血清，进行IL-2、IL-4、以及IFN-γ细胞因子的检测。IL-2细胞因子检测结果显示(图3A),CHIKV重组痘苗病毒免疫组的IL-2细胞因子高于重组痘苗病毒组和PBS组，但差异不显著。IL-4细胞因子检测结果显示(图3B),CHIKV重组痘苗病毒免疫组的IL-4细胞因子显著高于重组痘苗病毒组(P<0.05)。IFN-γ细胞因子检测结果显示(图3C),CHIKV重组痘苗病毒免疫组的IFN-γ细胞因子显著高于重组痘苗病毒组(P<0.05)和PBS组(P<0.05)。

图2 CHIKV重组痘苗病毒免疫小鼠血清特异性抗体检测

图3 CHIKV重组痘苗病毒免疫小鼠血清细胞因子检测

4 CHIKV重组痘苗病毒免疫小鼠脾脏T细胞亚类分析

各实验组首次免疫35 d时，随机选取3只小鼠分离脾脏淋巴细胞通过流式检测技术分析T细胞亚类情况。T细胞亚类分析检测结果显示，免疫CHIKV重组痘苗病毒免疫组和重组痘苗病毒免疫组的CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞比例均升高，高于PBS组。但免疫CHIKV重组痘苗病毒免疫组的CD3+CD4+T细胞(P<0.05,图4A)和CD3+CD8+T细胞(P<0.05,图4B)比例显著高于PBS组。

5 CHIKV重组痘苗病毒免疫小鼠的攻毒保护评价

小鼠生存率观察结果显示，CHIKV重组痘苗病毒免疫组小鼠体重趋于稳定，活动能力良好。而重组痘苗病毒组和PBS组的小鼠，体重出现下降，同时伴有活动能力下降(图5)。

3、讨论

基孔肯雅病毒(CHIKV)是一种通过蚊子传播的病毒，最近在全球多个地区再次出现，并导致大规模疫情爆发。在最近的疫情中，基孔肯雅热的非典型表现包括严重的关节痛和神经系统并发症，如脑炎、脑膜炎和格林-巴利综合征[12]。病毒进化、气候变化等多种因素可能导致了CHIKV的传播。目前，CHIKV的主要挑战之一是缺乏有效的预防疫苗和经批准的抗病毒治疗方法。因此针对CHIKV的防治工作应引起广泛关注。

图4 CHIKV重组痘苗病毒免疫小鼠脾脏T细胞亚类检测

图5 CHIKV重组痘苗病毒免疫不同时间小鼠体重变化

本研究基于重组痘苗病毒表达系统构建了CHIKV的E1基因的重组痘苗病毒疫苗，并通过WB、PCR等检测手段证明重组痘苗病毒可以成功表达外源蛋白(图1)。之前的研究指出CHIKV的E1蛋白于病毒的凝血活性有着密切的关系，且E1蛋白中含有中和抗体表位和T细胞抗原表位[13]。此外，CHIKV的E1蛋白具有良好的保守性[14],E1蛋白中的中和表位可以更好的诱导机体产生中和抗体进行抗病毒作用[15]。本研究将CHIKV重组痘苗病毒候选疫苗小鼠后，可以有效诱导小鼠机体产生特异性抗体和IL-4细胞因子的分泌，表明CHIKV重组痘苗病毒可以有效诱导机体产生体液免疫应答。此外，CHIKV重组痘苗病毒免疫组的小鼠的IFN-γ细胞因子的表达，以及CD3+CD4+T细胞和CD3+CD48+T细胞比例升高，也表明CHIKV重组痘苗病毒可以有效诱导机体产生细胞免疫应答。

本研究中表达CHIKV的E1蛋白的重组痘苗病毒，可以有效的诱导小鼠机体产生细胞免疫和体液免疫应答反应，该候选疫苗可能是一种有效的抗CHIKV感染疫苗，本研究可为CHIKV的疫苗研发提供理论依据。

参考文献:

[9]丛佳南.SARS-CoV-2重组痘苗病毒载体疫苗的构建､筛选和免疫原性研究[D].吉林大学2021.

[10]韩继成,靖杰,肖朋朋,等.欧洲型PRRSV重组痘苗病毒候选疫苗猪体免疫效果研究[J].中国病原生物学杂志,2015,10(8):673-676.

[11]韩继成,任静强,孙文超,等.欧洲型PRRSV､PCV2二联重组痘苗病毒疫苗猪体免疫实验研究[J].中国病原生物学杂志,2014,9(10):869-872,876.

基金资助:吉林省青年科技人才托举工程项目(No.QT202228);

文章来源:张金鑫,肖妍,李菁菁,等.基孔肯雅病毒(CHIKV)重组痘苗病毒候选疫苗小鼠免疫研究[J].中国病原生物学杂志,2024,19(04):378-381.