炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）是一类胃肠道慢性、非特异性、炎症性疾病的统称，包含克罗恩病和溃疡性结肠炎2个亚型[1]。IBD是我国消化系统常见疑难疾病之一，也是消化系统疾病基础研究和临床诊疗的重点、热点和难点。近20年，我国IBD发病率逐年上升，预计到2025年可达15万人，居亚洲之首[2]。目前普遍认为，遗传易感性、环境因素、机体免疫功能障碍、肠道菌群改变及肠黏膜屏障功能受损是IBD发生发展的主要原因[3]。IBD的临床治疗以药物治疗为主，主要包括氨基水杨酸类、抗生素、皮质激素类和免疫抑制剂等[4]，但上述药物容易导致多种不良反应，且患者长期使用会产生耐受性，停药后易复发[5]。

中药作为我国传统的优势资源，在治疗慢性疾病方面具有疗效明确、复发率低、不良反应少等优势。有“沙漠人参”之称的肉苁蓉来源于列当科植物肉苁蓉Cistanche deserticola Y.C.Ma或管花肉苁蓉C.tubulosa(Schenk)Wight的干燥带鳞叶的肉质茎，是新疆特色优势药用资源，主要含有苯乙醇苷类、萜类等活性成分，具有补肾壮阳、润肠通便的作用，被广泛用于肠道疾病的治疗[6―7]。苯乙醇苷类成分是2020年版《中国药典》（一部）规定的用于肉苁蓉鉴别和含量测定的指标性成分（主要为松果菊苷和毛蕊花糖苷）[8]。研究显示，松果菊苷可通过促进肠上皮细胞增殖而抑制细胞凋亡改善小鼠结肠炎[9]；毛蕊花糖苷作为自由基清除剂可减缓大鼠结肠炎进展[10]；肉苁蓉总苷可通过抑制炎症因子表达防治IBD[11]。但是肉苁蓉中具体是哪些化学成分通过哪些靶点和信号通路对IBD起到治疗作用尚未有研究报道。为此，本研究拟通过网络药理学方法结合分子对接技术，对肉苁蓉治疗IBD的潜在作用机制进行预测，并对预测结果进行药效学验证，从而系统地阐明肉苁蓉治疗IBD的分子机制，以期为其后续开发利用提供理论依据。

1、材料

1.1实验动物

本研究所用动物为雄性SPF级C57BL/6小鼠，共48只，购自新疆医科大学动物实验中心，体重18～20 g，实验动物生产许可证号为SCXK（新）2023-0004，实验动物使用许可证号为SYXK（新）2023-0001。小鼠饲养在温度为（22±2）℃，相对湿度为50%～70%，循环照明12 h的环境中。本研究严格遵守动物福利和新疆医科大学实验动物伦理委员会伦理要求（审批号为20210301-177）。

1.2主要药品与试剂

肉苁蓉提取物（Cistanche extract,CE；纯度≥85%，其中松果菊苷≥40%，毛蕊花糖苷≥16%；批号20230103）购自新疆和田帝辰医药生物科技有限公司；葡聚糖硫酸钠（DSS，相对分子量36 000～50 000，批号C16013701）购自上海麦克林生化科技有限公司；粪便隐血定性检测试剂盒（批号ml1095013）购自上海酶联生物科技有限公司；地塞米松对照品（纯度≥98%，批号54231207002）购自北京索莱宝科技有限公司；肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6）、IL-10、IL-1β、髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）酶联免疫吸附测定试剂盒（批号分别为88-7324、88-7064、88-7105、88-7013、EMMPO）均购自美国Invitrogen公司；兔源TNF-α、蛋白激酶B1(protein kinase B1,AKT1）、磷酸化AKT1(p-AKT1）、信号转导和转录激活因子3(signal transduction and activa‐tor of transcription 3,STAT3）、磷酸化STAT3(p-STAT3）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）、非受体酪氨酸激酶（SRC）、磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase,PI3K）、磷酸化PI3K(p-PI3K）和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（批号分别GB11188、GB11689、GB150002、GB11176、GB150001、GB115662、GB112343、GB112544、GB11525、GB23303）均购自武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.3主要仪器

本研究所用主要仪器有Multiskan Go型全波长酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司），RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司），Gel.Doc.XR型凝胶电泳成像分析系统、Mini Trans-Blot型蛋白印迹仪（美国Bio-Rad公司）。

2、方法

2.1网络药理学分析

2.1.1活性成分及靶点预测

通过TCMSP平台（http：//lsp.nwu.edu.cn/）筛选肉苁蓉活性成分（以口服利用度≥30%、类药性≥0.18为筛选条件）[12]，并补充已有文献报道的具有抗IBD作用的肉苁蓉活性成分。采用Swiss Target Prediction平台检索肉苁蓉活性成分靶点（probability参数>0），去除重复项后得到肉苁蓉活性成分靶点。以“inflammatory bowel disease”为检索词，分别从Gene Cards数据库（http：//www.genecards.org/）和OMIM数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）收集疾病靶点，删除重复项后得到潜在靶点。

2.1.2韦恩图绘制及“药物-成分-靶点-疾病”交互网络构建

借助Venny 2.1在线分析工具将肉苁蓉活性成分靶点与潜在靶点取交集，得到肉苁蓉治疗IBD的潜在靶点。采用Cytoscape 3.9.1软件构建“药物-成分-疾病-靶点”多层次网络图并进行拓扑学分析。选取度值（即degree值）排前4位的成分作为肉苁蓉治疗IBD的核心成分。

2.1.3蛋白质-蛋白质相互作用网络绘制

将肉苁蓉治疗IBD的潜在靶点导入STRING数据库（http：//string-db.org/），将物种限定为“Homo sapiens”，交互分数限定为>0.4，绘制蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction,PPI）网络，并计算各靶点的degree值，以degree值排名前5位的靶点作为核心靶点。

2.1.4潜在靶点的功能和通路富集分析

将肉苁蓉治疗IBD的潜在靶点导入DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov）进行基因本体（gene ontology,GO）、京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路分析，并利用微生信在线平台（https：//www.bioinformatics.com.cn/）进行可视化展示。以富集到的相应通路的靶点数和-lg P值衡量富集程度；GO分析中选取排前10位的条目绘制柱状图，KEGG分析中选取排前20位的通路绘制气泡图。

2.1.5分子对接

采用Auto Dock Vina软件对筛选出的核心靶点（TNF、AKT1、STAT3、EGFR和SRC）与核心成分（槲皮素、苏齐内酯、β-谷甾醇、肉苁蓉苷H）进行分子对接验证。结合自由能越低，表明该核心成分与受体蛋白结合的亲和力越高[13]。

2.2动物实验验证

2.2.1造模、分组及给药

雄性C57BL/6小鼠（6～7周）48只，适应性饲养1周后按体重分为空白对照组、模型组、阳性对照组（地塞米松，0.4 mg/kg，剂量根据临床等效剂量换算）和CE低、中、高剂量组（100、200、400 mg/kg，剂量参考文献[14]设置），每组8只。空白对照组小鼠每天正常进食饮水，模型组和给药组小鼠每天自由饮用3%DSS溶液以造模，自由进食。造模同时，CE各剂量组小鼠灌胃相应剂量的CE（临用时以蒸馏水溶解），阳性对照组小鼠腹腔注射地塞米松，空白对照组与模型组小鼠每天以0.01 m L/g灌胃灭菌水，每天1次，连续7 d。实验期间，模型组、阳性对照组和CE低剂量组各死亡小鼠1只。末次给药后，禁食12 h，麻醉后摘眼球取血及结肠组织备用。

2.2.2疾病活动指数计算及结肠长度检测

实验期间，每天记录小鼠体重和粪便情况，参照评分标准[15]评价各组小鼠的体重下降、粪便性状和便血情况，并计算疾病活动指数（disease activity index,DAI),DAI=（体重减轻分数+粪便性状分数+大便潜血或结肠出血分数）/3。实验结束后，取小鼠结肠测量长度并拍照。

2.2.3结肠组织病理学形态观察

取部分小鼠结肠组织以4%多聚甲醛固定，经石蜡包埋、切片后，进行苏木素-伊红（HE）染色。采用显微镜观察小鼠结肠组织病理学形态，并根据隐窝细胞丢失和炎症细胞浸润程度进行病理学评分[16]。

2.2.4结肠组织中炎症因子水平检测

取部分小鼠结肠组织于冰上匀浆，匀浆液于4℃下以3 500 r/min离心15 min，收集上清液，按试剂盒说明书方法操作，采用酶标仪检测血清中IL-10、IL-6、IL-1β、TNF-α、MPO水平。

2.2.5结肠组织中核心靶点蛋白表达检测

每组取3只小鼠的结肠组织适量，采用Western blot法验证基于网络药理学筛选出的核心靶点的蛋白表达情况，采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以β-actin为内参，计算各蛋白的表达水平。

2.3统计学方法

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。计量资料采用表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

3、结果

3.1网络药理学预测结果

3.1.1活性成分的筛选及疾病靶点预测

通过TCMSP平台筛选得到6个活性成分，通过查询文献补充33个活性成分，最终得到39个活性成分，详见表1。通过Swiss Target Prediction平台筛选得到肉苁蓉活性成分靶点433个，通过Gene Cards和OMIM数据库检索得到IBD靶点2 858个。活性成分靶点与疾病靶点取交集得到232个肉苁蓉活性成分治疗IBD的潜在靶点。

3.1.2“药物-成分-靶点-疾病”网络筛选核心成分

“药物-成分-靶点-疾病”网络（图1）共包含273个节点和854条边，核心成分分别为槲皮素（degree值=60）、苏齐内酯（degree值=56）、β-谷甾醇（degree值=52）、肉苁蓉苷H(degree值=45）。

3.1.3 PPI网络筛选核心靶点

PPI网络（图2）共包含231个节点和7 394条边，核心靶点分别为TNF(degree值=308）、AKT1(degree值=290）、STAT3(degree值=252）、EGFR(degree值=230）、SRC(degree值=230）。

表1 肉苁蓉中39个活性成分的基本信息

图1“药物-成分-靶点-疾病”交互网络

图2 PPI网络图

3.1.4 GO和KEGG富集分析

从图3和图4可知，肉苁蓉治疗IBD的生物过程主要与蛋白质磷酸化、凋亡负调控、对外源性刺激的反应等有关，主要涉及PI3K/AKT、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药等信号通路。

图3 肉苁蓉治疗IBD潜在靶点的GO富集分析

3.1.5分子对接验证

分子对接验证结果（表2）显示，核心靶点与核心成分的结合能均小于-4.7 k J/mol，表明配体分子均能和受体蛋白较好地结合，其中AKT1与β-谷甾醇的结合性最好。

3.2动物实验结果

3.2.1 CE对小鼠体重的影响

与空白对照组比较，模型组小鼠体重显著降低（P<0.01）；与模型组比较，阳性对照组和CE各剂量组小鼠体重均显著升高（P<0.05或P<0.01）。结果见表3。

图4 肉苁蓉治疗IBD潜在靶点的KEGG通路分析

表2 核心成分与核心靶蛋白的对接结果

表3 各组小鼠体重、DAI、结肠长度、病理评分检测结果（)

3.2.2 CE对小鼠DAI、结肠长度的影响

与空白对照组比较，模型组小鼠DAI显著升高，结肠长度显著缩短（P<0.01）；与模型组比较，阳性对照组和CE各剂量组大鼠DAI均显著降低，结肠长度均显著增长（P<0.05或P<0.01）。结果见表3和图5。

图5 各组小鼠结肠观察图

3.2.3 CE对小鼠结肠组织病理学形态的影响

空白对照组小鼠结肠黏膜完整、结构清晰，未发现炎症细胞浸润及溃疡；模型组小鼠结肠黏膜不完整，大部分腺体被破坏，部分杯状细胞消失，隐窝结构被破坏；与模型组比较，阳性对照组和CE各剂量组小鼠结肠组织损伤情况有所好转，结肠组织炎症细胞浸润和腺体破坏情况明显减少，炎症程度明显减轻，结肠组织病理学评分显著降低（P<0.05或P<0.01）。结果见图6、表3。

图6 各组小鼠结肠组织病理学形态显微图（HE染色）

3.2.4 CE对小鼠结肠组织中炎症因子水平的影响

与空白对照组相比，模型组小鼠结肠组织中IL-6、IL-1β、MPO、TNF-α水平均显著升高（P<0.05或P<0.01),IL-10水平显著降低（P<0.01）；与模型组相比，阳性对照组和CE各剂量组小鼠结肠组织中IL-6、IL-1β、MPO、TNF-α水平均显著降低（P<0.05或P<0.01),IL-10水平显著升高（P<0.01）。结果见表4。

3.2.5小鼠结肠组织中核心靶点蛋白表达水平

与空白对照组相比，模型组小鼠结肠组织中PI3K、p-PI3K、EGFR、TNF-α、STAT3、p-STAT3、AKT1、p-AKT1、SRC蛋白表达水平均显著升高（P<0.05或P<0.01）；与模型组相比，阳性对照组和CE各剂量组小鼠结肠组织中上述蛋白表达水平均显著降低（P<0.05或P<0.01）。结果见图7、表5。

表4 小鼠结肠组织中炎症因子水平比较（)

图7 各组小鼠结肠组织中核心蛋白表达的电泳图

4、讨论

本研究中，分子对接实验结果表明，核心成分槲皮素、苏齐内酯、β-谷甾醇、肉苁蓉苷H与核心靶点TNF、AKT1、STAT3、EGFR、SRC显示出较强的结合能力，体现了肉苁蓉多成分-多靶点协同发挥作用的特点。研究表明，槲皮素可以显著抑制炎症因子和炎症介质的分泌与释放，具有良好的抗炎作用[17]。苏齐内酯能够有效促进免疫细胞分泌γ-干扰素，并具有提高免疫细胞活力、降低肿瘤细胞活力的作用，且苏齐内酯与槲皮素在促进免疫细胞分泌γ-干扰素方面还具有协同作用[18]。β-谷甾醇可通过下调IL-6、IL-1β、TNF-α等炎症因子水平来缓解结肠炎进展[19]。肉苁蓉苷H可通过甘油磷脂代谢和花生四烯酸代谢等信号通路来调节氧化应激和炎症反应[20]。由此可知，槲皮素、苏齐内酯、β-谷甾醇、肉苁蓉苷H可能是肉苁蓉治疗IBD的物质基础。

表5 各组小鼠结肠组织中核心靶点蛋白表达水平比较（,n=3)

KEGG通路分析显示，肉苁蓉主要通过调节PI3K/AKT、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性等信号通路对IBD发挥治疗作用。研究指出，PI3K/AKT信号通路的激活可促使炎症因子释放从而引发炎症损伤[21]。SRC是PI3K/AKT信号通路的上游信号分子，DSS进入细胞内能迅速激活SRC/PI3K/AKT信号通路，促进巨噬细胞、中性粒细胞等先天性免疫细胞募集至炎症受损组织，从而加速炎症因子的释放，加剧机体炎症反应[22]。EGFR可通过与上游相关蛋白结合发生磷酸化，激活PI3K/AKT信号通路，进而与Wnt信号通路协同介导炎症反应[23]。AKT1可激活核因子κB，从而促进促炎因子的合成与释放，加速炎症反应[24]。STAT3是JAK/STAT信号通路的核心靶蛋白，当STAT3被迅速激活后，可加速IL-6、IL-1β等炎症因子的释放，从而导致炎症浸润加剧[25]。TNF-α是免疫反应中最先释放的细胞因子，可通过不同的机制介导肠道炎症，还可直接诱导肠上皮细胞凋亡[26]。由此可知，TNF-α、AKT1、STAT3、EGFR、SRC可能是肉苁蓉治疗IBD的核心靶点。进一步通过动物实验发现，CE可降低上述蛋白的表达水平，证明了网络药理学预测靶点的准确性。

综上所述，本研究通过网络药理学和动物实验系统地证实了肉苁蓉治疗IBD的作用，其具体作用机制可能与调节SRC/EGFR/PI3K/AKT信号通路有关。

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基金资助:国家自然科学基金项目(No.82160772);

文章来源:谯明,朱毅,胡君萍,等.肉苁蓉治疗炎症性肠病的作用机制预测及验证[J].中国药房,2024,35(21):2582-2589.