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重庆市3960例流感病毒阴性流感样病例肠道病毒检测及分型分析

2024-01-19 30 上传者：管理员

摘要：目的了解肠道病毒(Enterovirus, EV)在重庆市流感病毒阴性流感样病例(Influenza-like illness, ILI)中的流行特征以及基因型分布，为重庆市EV防控提供科学依据。方法收集重庆市流感监测点送检流感病毒阴性ILI病例咽拭子标本，使用荧光RT-PCR检测EV,EV阳性样本扩增VP4区片段并测序分型。结果 2021年1～12月共收到3 960例流感病毒阴性ILI标本，检出EV阳性316例(7.98%);重庆市流感病毒阴性ILI病例全年均能检出EV,检出率较高月份为1月(11.60%)、4月(10.56%)、5月(11.79%)、6月(12.62%)、7月(10.33%),不同区域、不同性别、不同年龄组的ILI病例EV检出率差异有统计学意义(χ2=29.647,χ2=4.192,χ2=69.176,P<0.05);213例阳性EV被成功分型，包含EV-A、EV-B、EV-C的17个型别和鼻病毒B组(HRV-B)的5个型别，优势型别为CV-A4(32.86%)、CV-A2(23.00%)、CA-6(12.21%)、CA-10(11.74%),未鉴定出EV-D和新型EV。结论 EV是重庆市ILI病例的重要病原体，重庆市ILI病例中流行的EV具有典型区域性、季节性、以及人群特点，应根据EV流行特征在重庆地区开展防控工作。

关键词：
VP4区
基因分型
流感样病例
肠道病毒
脊灰病毒
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肠道病毒(Enterovirus, EV)隶属于小RNA病毒科(Picornaviridae),目前已经确定了200多种不同的血清型[1]。其中，除脊灰病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒之外，用分子生物学方法新鉴定的其它肠道病毒称为新型肠道病毒。近年来，肠道病毒引起呼吸道感染相关报道逐渐增加，有研究指出在上呼吸道感染引起的疾病病例中，肠道病毒感染占有很大比重[2]。经呼吸道传播的疾病如新型冠状病毒肺炎等往往容易发生超级传播而造成更广泛和更严重的后果[3],因此呼吸道传播的肠道病毒在全球范围内引起了广泛关注[4]。ILI是一组临床综合症的统称，包括发烧、咳嗽、喉咙痛等[5]。研究依托于流感监测系统，对流感病毒阴性ILI病例进行肠道病毒检测及基因分型，为重庆地区呼吸道感染以及呼吸道传播肠道病毒防治提供实验室诊断资料及病原学依据。

1、材料与方法

1.1标本来源

收集2021年重庆市6个流感监测点疾控中心(巴南区、涪陵区、黔江区、万州区、渝北区、渝中区)送检的流感病毒阴性流感样病例咽拭子标本，标本采集由各流感监测哨点医院完成。收到标本保存于-70℃待检。

1.2 EV核酸检测

使用硕世全自动核酸提取仪(SSNP-3 000A)及配套试剂耗材进行标本核酸提取，每份标本核酸提取加样量为200μL。采用荧光定量RTP-PCR方法进行肠道病毒核酸检测，参照《手足口病诊断-WS588-2018》附录B中肠道病毒检测方法和判断标准。检测试剂为宝生物(Takara)RT-PCR试剂盒(Prime Script One Step RT-PCR Kit Ver.2)。

1.3目的片段扩增及核苷酸序列测定

对1.2中阳性标本，扩增VP4区片段，扩增引物为EV543F/EV1197R[6]。使用Takara试剂盒(Prime Script One Step RT-PCR Kit Ver.2)扩增，反应体系为25μL,其中上下游引物各1μL,RNA 5μL。反应条件为：50℃,30min; 94℃,2min; 94℃,30sec, 58℃,30sec, 72℃,60s,循环45次；72℃延伸8min。扩增产物为655bp,扩增产物由华大基因科技有限公司进行序列的测定。

1.4序列拼接整理及EV型别确定

使用DNA STAR软件中SeqMan功能对双向序列进行拼接，查看测序峰图，依据峰图校对、修正序列，获得序列保存为FASTA格式。在NCBI网站https: //www.ncbi.nlm.nih.gov上对序列进行一在线比对，以一致性评分选项(Percent Identify)最高已知序列型别作为待鉴定EV序列的分型结果。

1.5统计学方法

使用Excel 2010软件进行病例信息的录入、数据整理、表格制作，使用SPSS 26.0软件，对组间进行χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1各监测点流感病毒阴性ILI肠道病毒检测情况

2021年，累计收到各监测点上送的流感病毒阴性流感样病例咽拭子标本3 960例，经荧光定量RT-PCR检测，EV阳性316例，阳性率7.98%(316/3 960)。其中EV阳性率最高监测点是黔江区，阳性率12.52%(77/963);EV阳性率最低的是渝中区4.15%(21/506)。按照重庆市中心城区(巴南区、渝北区、渝中区)与非中心城区(涪陵区、黔江区、万州区)划分，研究中心城区监测点EV阳性率为5.17%(84/1 625),低于非中心城区监测点EV阳性率9.94%(232/2 335),差异有统计学意义(χ2=29.647,P<0.05),各监测点送样检测情况(表1)。

表1各监测点流感病毒阴性ILI病例EV检测情况

2.2 EV检测季节分布

2021年1～12月期间的采样标本，每月均有检出EV阳性，检出阳性率较高的月份是1月11.60%(21/181)、5月11.79%(66/560)、6月12.62(76/602)、7月10.33%(38/368),其他月份阳性率均低于5%(图1)。其中EV阳性率最高的是月份是6月12.62%(76/602),最低月份是12月2.99%(2/67)。

2.3 EV阳性人群特点

3 960例病例中，男性病例EV阳性率8.81%(185/2 100),女性病例EV阳性率7.04%(131/1 860),差异有统计学意义(χ2=4.192,P<0.05),阳性病例男女性别比为1.41∶1。将病例分为四个年龄组，EV阳性率最高的是3～年龄组13.17%(127/964),最低的是18～年龄组3.60%(45/1 249)(表2),各年龄组EV阳性率差异有统计学意义(χ2=69.176,P<0.05)。

图1 3 960例流感病毒阴性ILI病例EV检测季节分布

表2不同年龄组病例肠道病毒检测情况

2.4 EV分型情况

316例阳性标本经扩增测序，成功测序213例(67.41%),经序列鉴定，鉴定出207例17个型别的EV,包含A组7个型别(49例CV-A2、70例CV-A4、6例CV-A5、26例CV-A6、8例CV-A8、25例CV-A10、1例CV-A16)、B组9个型别(1例CV-A9、5例CV-B2、5例CV-B3、1例E-3、1例E-6、1例E-7、2例E-18、2例E-21、3例E-30)、C组1个型别(1例CV-A21),6例鼻病毒B组(HRV-B)含5个型别(1例HRV-B3、1例HRV-B6、2例HRV-B48、1例HRV-B70、1例HRV-B72),未鉴定出新型EV。主要感染型别为CV-A4(32.86%)、CV-A2(23.00%)、CA-6(12.21%)、CA-10(11.74%),从季节分布看，有明显的病原谱变化。春季(2～4月)主要是CV- A2和CV-A4的流行，夏季(5～7月)主要是CV-A6和CA-10的流行。此外CV-A6和CA-10还主要在1月流行。HRV主要流行于秋冬季节(9～11月)。其他各型别EV主要流行于夏季(5～7月)。

3、讨论

除脊灰病毒和EV-A71外，大多EV缺乏有效疫苗和抗病毒药物[7,8]。在中国，脊髓灰质炎和手足口病由于疫苗使用，得到了较好控制[9]。为进一步了解EV在重庆的流行特征，尤其是呼吸道传播的EV流行现状，将重庆市ILI病例用于肠道病毒研究有重要意义。

各监测点EV阳性率差别较大，从4.15%到12.52%,非中心城区EV阳性率9.94%明显高于中心城区5.17%,可能是非中心城区的卫生条件落后于中心城区，且具备人口聚集、公共设施使用频繁等条件，更利于EV传播流行[10]。为进一步核实原因，还需强化相关地区病原监测，同时在重庆市非中心城区应加强EV相关疾病的防控。

在对EV引起的手足口病相关研究中发现，EV流行具有典型季节特点，流行高峰多在夏季，且呈现出双峰分布[11],研究检出EV季节分布也呈现双峰分布，4～7月的EV阳性病例较集中，占全部EV阳性病例的73.10%,值得注意的是研究显示1月为另一个EV高峰，提示在重庆地区应警惕EV反季节流行。

中国EV相关疾病研究显示男性病例明显多于女性[12,13],该研究也呈现出这种流行病学特征，有研究表明，雌激素对CV-B3引起的心机炎时，有积极作用[14],雌激素在机体防御EV中是否有积极作用值得开展关联研究。EV阳性率最高的是3～6岁年龄组，与手足口病研究结果相似，因此在重庆地区应加强幼儿园适龄儿童呼吸道相关EV的防控。

A组EV在重庆地区最常见，与国外关于肠道病毒分型的相关研究相似[15]。A组肠道病毒中EV-A71曾是重庆地区手足口病的主要病原体，研究未检出EV-A71,并且2015年之后重庆地区急性弛缓性麻痹病例的研究中也未检出EV-A71,可印证使用疫苗对EV-A71有较好的防控效果[16]。鉴定出的6例HRV均属于HRV-B,检出率低于国内外的相关研究[17,18],可能原因是检测引物为EV属特异性引物，缺乏对鼻病毒的特异性，不能够真实反应重庆市流感样病例感染鼻病毒的真实感染率，需进一步实验核实。研究标本中未检出新型EV,也没检出EV-D,表明2021年重庆地区流行的EV型别较单一，可能与新冠疫情常态化防控下，一些输入EV不能够在重庆地区有效传播有关。

总之，重庆市流感样病例中流行的EV有明显的优势型别，并呈现出地域性、季节性、人群特点，需针对性的开展防控，警惕呼吸道传播EV相关疾病暴发风险。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献:

[6]王建,邵永强,孙宝昌,等.基于5′UTR-VP4-VP2区测序鉴定手足口病肠道病毒[J].病毒学报,2020,36(5):770-777.

[9]韦跃,谢友军,陈月华,等.EV71灭活疫苗预防适龄儿童重症手足口病效果研究[J].公共卫生与预防医学,2022,33(3):37-40.

[13]彭靖尧,赵华,黄为,等.重庆市2013-2018年急性弛缓性麻痹病例流行病学分析[J].检验医学与临床,2020,17(17):2468-2470+2475.

[17]李海明,李俊,王婷.北京地区上呼吸道感染发生情况及病毒感染亚型分布调查[J].公共卫生与预防医学,2022,33(1):128-131.

基金资助:重庆市科卫联合医学科研项目(2020FYYX095);

文章来源:彭靖尧,罗肖怡楠,赵华等.重庆市3960例流感病毒阴性流感样病例肠道病毒检测及分型分析[J].公共卫生与预防医学,2024,35(01):53-56.